ГАЗОВАЯ ХРОМАТОГРАФИЯГазовая хроматография (ГХ) представляет собой метод разделения, основанный на различном распределении образца между двумя несмешивающимися фазами, в котором подвижной фазой является газ (газ-носитель), а неподвижной фазой, помещенной в колонку, — твердое вещество или жидкость, нанесенные на твердый инертный носитель или равномерно покрывающие внутренние1 стенки колонки. Газовая хроматография основана на механизмах адсорбции, распределения или эксклюзии. ПРИБОР Прибор состоит из блока ввода проб (инжектора), хроматографической колонки, помещенной в термостат, детектора и регистрирующего устройства (интегрирующее устройство или самописец). Газ-носитель лроходит с заданной скоростью или давлением через колонку, а затем через детектор. Определение проводят при постоянной температуре колонки или в соответствии с заданной температурной программой. БЛОК ВВОДА ПРОБ (ИНЖЕКТОР) Прямой ввод растворов является обычным способом ввода проб, если в частной статье нет других указаний. Ввод пробы может осуществляться либо непосредственно в начало колонки с использованием шприца или инжекторного клапана, либо в испаритель, который может оснащаться делителем потока. ввод паровой фазы может осуществляться с использованием статической или динамической парофазной системы ввода. Динамическая парофазная (продувка и уловитель) система ввода включает барботажную)£тановку, при помощи которой летучие вещества в растворе продуваются в абсорбирующую колонку при невысокой температуре. Задержанные на колонке вещества затем десорбируются в подвижную фазу при быстром нагревании абсорбирующей колонки. Статическая парофазная система ввода включает термостатируемую нагревающую камеру для образцов, в которую помещены закрытые виалы с твердыми или жидкими образцами на фиксированный период времени, позволяющий летучим компонентам образца достичь равновесия между негазовой и паровой фазами. После достижения равновесия заданное количество паровой фазы из виал вводится в газовый хроматограф. НЕПОДВИЖНАЯ ФАЗА Колонки с помещенной в них неподвижной фазой могут быть описаны следующим образом: - капиллярные кварцевые колонки с покры - колонки, заполненные инертными части - колонки, заполненные твердой неподвиж Капиллярные колонки имеют внутренний диаметр (0) от 0,1 мм до 0,53 мм и длину от 5 м до 60 м. Жидкость или неподвижная фаза, которая может быть химически связана с внутренней поверхностью, представляет собой пленку с толщиной слоя от 0,1 мкм до 5,0 мкм. Набивные колонки, изготовленные из стекла или металла, имеют длину обычно от 1 м до 3 м и внутренний диаметр (0) от 2 мм до 4 мм. Неподвижная фаза обычно состоит из пористых полимеров или твердых носителей, импрегниро-ванных жидкой фазой. Носители для анализа полярных соединений на колонках, набитых малоемкой малополярной неподвижной фазой, должны быть инертными для предотвращения образования пиков с размытым тылом. Реакционная способность носителей может быть снижена путем си-ланизации, предшествующей нанесению жидкой фазы. Обычно используют обработанный кислотой и прокаленный диатомит. Размер частиц может быть разным, но наиболее часто используются частицы размером от 150 мкм до 180 мкм и от 125 мкм до 150 мкм. ПОДВИЖНАЯ ФАЗА Время удерживания и характеристики зависят от скорости потока газа-носителя; удерживания прямо пропорционально длине поломки, а разрешение пропорционально квадратному корню из длины колонки. Для набивных колонок скорость потока газа-носителя обычно выражают в миллилитрах в минуту при атмосфер- Государственная фармакопея Республики Беларусь
сырье. График проверяют на линейность. Если содержание охратоксина А в испытуемом; ^образ* це выходит за пределы калибровки, испытуемый раствор может быть разведен до получения подходящей концентрации охратоксина А. Условия хроматографирования: - колонка длиной 0,15 м и внутренним ди - температура: 45 °С; - подвижная фаза:
- подвижная фаза А: вода Р, доведенная - подвижная фаза В: ацетонитрил Р;
-скорость подвижной фазы: 0,8 мл/мим; - флуоресцентный детектор, рекр,менду- - объем вводимой пробы: 20 мкл. по градуировочному графику, на котором по оси абсцисс откладывают концентрацию охратоксина А (нг/мл), а по оси ординат — сигнал (S). Концентрация охратоксина А в испытуемом растворе равна. а Содержание охратоксина, А в лекарственном растительном сырье (нг/г) рассчитывают по формуле: Ц-Ц,-С ш-Ц где: т — масса лекарственного растительного сырья, взятая для анализа, г; V, — объем разведения, мл; Vi — аликвота, взятая для иммунно-аффин-ной очистки, мл; V2 — объем раствора, в котором фцл растворен сухой остаток, мл; С — найденная концентрация охратоксина А в испытуемом растворе, нг/мл. Приложение: процедуры обеззараживания лабораторной посуды Стеклянную посуду ополаскивают метанолом Р и обеззараживают, выдерживая ее в рас-творе натрия гидроксидакощентриров&цномР в течение не менее 2 ч. Тщательно промыэвют водой. 01/2013:20623 2.8.23. 'МАКРОСКОПИЧЕСКИЙ И# МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ ^МАКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Макроскопический анализ сводится к изучению внешнего вида лекарственного растительного сырья, определению размеров отдельных частей, органолептических показателей (цвета, запаха), морфологических диагностических признаков. Размеры сырья определяются с помощью измерительной линейки: для крупных объектов (более 3 см) — 3—5 измерении, для мелких — 10—20 измерений. Мелкие семена и плоды измеряют на миллиметровой бумаге и рассчитывают среднее значение. Определяют цвет сырья поверхности на изломе или в разрезе при дневном освещении. Залах определяют при растирании между пальцами на изломе: или при растирании в стулке. Морфологические диагностические признаки определяют для всех видов сырья. Высушенные и смятые части сырья предварительно размягчают во влажной камере или путем погружения на несколько минут в горячую воду, после чего раскладывают на стеклянной пластинке, тщательно расправляя. Рассматривают невооруженным глазом или с помощью лупы (10*). Листья (Folia) —- лекарственное сырье, представляющее собой высушенные или свежие листья или отдельные листочки сложного листа. Диагностическими признаками являются: тип листьев (простые или сложные), форма и размеры листовой пластинки и черешка, характер края, жилкование, опушвнность. Цветки (Flores) — лекарственное сырье, представляющее собой высушенные отдельные цветки или соцветия, а также их части. Диагностическими признаками являются: тип соцветия, опушенность, форма и размеры цветка, строение околоцветника (число, форма и характер фастания чашелистиков и лепестков), число и строение тычинок и пестиков, характер завязи и цветоложа,. Травы (ЦегЬае) — лекарственное сырье, представляющее собой высушенные или свежие надземные части травянистых растений (стебли с листьями и цветками, отчасти с бутонами и незрелыми плодами). Диагностические признаки для листьев и цветков указаны выше. Для стеблей: тип ветвления, форма поперечного сечения, размеры (длина и диаметр у основания), характер поверхности, опушенность, листорасположение. Плоды (Fructus) •— высушенные или свежие простые или сложные плоды (соплодия) и их 1 23. Макроскопический и микроскопический анализ
•ест Диагностическими признаками являют-зе «консистенция околоплодника (перикарпия), яраетер поверхности, размеры (длина, толщи-•«hsl. поперечник плода), расположение остатков -асгей цветка и др. Семена (Semina) — цельные семена или щавельные семядоли. Исследуются сухими. 1кагностические признаки: форма, размеры диина, толщина, поперечник), характер поверхности. цвет, запах, форма, размеры и расположение зародыша, наличие и форма рубчика или Кора (Cortices) — лекарственное сырье, •реаставляющее собой наружную часть ство--сб. ветвей и корней деревьев и кустарников, расположенную к периферии от камбия. Диагно-г-^ческие признаки: размеры и форма кусков, особенности наружной и внутренней пйверхно-гг* и излома. Корни, корневища, луковицы, клубни, клуб-~*епуковицы (Radices, Rhizomata, Bulbi, Tubera, -utootubera] — высушенные или свежие подзем--чые органы многолетних растений, очищенные *£*«отмытые от земли, освобожденные от остатнее стеблей и листьев. Диагностические призна- на форма, особенности наружной поверхности * ллома, размер, цвет поверхности и на свежем «згюме, запах. Сборы (Species) — смесь нескольких видов измельченного (реже цельного) лекарственно-— растительного сырья, иногда с добавлением:спей, эфирных масел. Сырье, используемое л-я приготовления сборов, должно соответство-зать требованиям нормативной документации -е каждый вид сырья. Анализ зависит от морфологической группы исследуемого объекта, а также от состояния сырья — цельного или измельченного. Размер ~е* эрственного растительного сырья указывают = частных статьях. Общие требования к измельченному лекар-г'венному растительному сырью, в том числе значения и допустимые нормы при ситовом ана-~иэе. описаны в общей статье Сборы, если не мазано иное в частных фармакопейных статьях, Г-епень измельчения указывают в скобках, на--омыер, измельченное сырье с частицами, про-» ездящими сквозь сито с размером стороны отверстия 5600 мкм, обозначают как измельченное сырье (5600). МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ "Микроскопический анализ зависит от мор-эсипогической группы испытуемого сырья, а -аосе от состояния сырья — цельного или из- мельченного.* 'ЛИСТЬЯ, ТРАВЫ, ЦВЕТКИ Цельное и измельченное сырье. При исследовании цельного сырья берут кусочки пластинки листа с краем и жилкой; у трав берут лист, иногда также кусочек стебля и цветок, у цветков — чашечку и венчик. При исследовании резаного сырья берут несколько различных кусочков. Просветление можно проводить двумя способами. I. Несколько кусочков сырья помещают в II. Кусочки кипятят в растворе хлоралги стекло в каплю раствора хлоралгидрата Р1 или глицерина Р, разделяют скальпелем или препаровальной иглой на две части, одну из них осторожно переворачивают. Объект накрывают покровным стеклом, слегка подогревают до удаления пузырьков воздуха и, после охлаждения, рассматривают лист с обеих сторон под микроскопом сначала прм малом, затем при большом увеличении, При приготовлении микропрепаратов из толстых листьев ИХ предварительно раздавливают скальпелем. Для исследования стеблей их отрезки кипятят в растворе 50 г/л натрия гидроксида Р, тщательно промывают водой Р, снимают эпидермис скальпелем или препаровальными иглами и рассматривают его с поверхности; из остальных тканей готовят препарат, раздавливая объект скальпелем на предметном стекле в растворе хлоралгидрата Р1 или растворе глицерина Р. При необходимости приготовления поперечных срезов листьев и стеблей их кипятят в растворе хлоралгидрата Р1 в течение 10 мин и делают срезы, зажимая кусочки листа в пробку или сердцевину бузины. Готовые срезы помещают в воду Р и далее используют для приготовления микропрепаратов, рассматривая их в растворе хлоралгидрата Р1* Исследование при-дополнительном измельчении. Для микроскопического испытания лекарственное растительное сырье дополнительно измельчают (355) (2.9. 12), если в частной статье не указано иное. Наиболее широко используемой средой для заключения в нее дополнительно измельченного сырья является раствор хлоралгидрата Р. Однако в этом реактиве не всегда хорошо видны некоторые элементы, в таком случае могут быть использованы иные среды, например, 50 % (об/об) раствор глицерина Р, позволяющий обнаружить зерна крахмала. При необходимости в частной статье может быть отмечено использование специфических реактивов, например, реактива молочной Государственная фармакопея Республики Беларусь
кислоты Р (использование которого позволяет обнаруживать различные диагностические признаки), раствора рутения красного Р (позволяющий увидеть присутствие слизи в клетках) или глицерина Р (в котором видны крахмал и инулин) и других. Использование раствора хлоралгидрата. 2 —3 капли раствора хлоралгидрата Р помещают на предметное стекло. Небольшое количество порошка суспендируют в растворе и накрывают покровным стеклом. Препарат очень аккуратно нагревают на плитке или на газовой микрогорелке до кипения и кипятят в течение непродолжительного времени, при необходимости с помощью пипетки добавляют реактив, охлаждают и просматривают под микроскопом. Нагревание повторяют до тех пор, пока крахмальные зерна и водорастворимое содержимое клеток не станет невидимым. Просматривают полученный препарат под микроскопом. Так как хлоралгидрат склонен к кристаллизации в виде длинных нитей, для предотвращения этого после нагревания удаляют покровное стекло, к препарату прибавляют 1 каплю 10 % (об/об) смеси раствора хлоралгидрата Р и глицерина Р, накрывают чистым покровным стеклом и просматривают под микроскопом. Использование 50 % (об/об) раствора глицерина. 2 капли 50 % (об/об) раствора глицерина Р помещают на предметное стекло. Небольшое количество порошка суспендируют в растворе и накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом. #ПЛОДЫ, СЕМЕНА Цельное сырье. Готовят препараты кожуры семени и околоплодника с поверхности или поперечные срезы. Препараты поверхности кожуры и околоплодника. 2 —3 семени или плода кипятят в пробирке в растворе 50 г/л натрия гидрокси- даРъ течение 2—3 мин и тщательно промывают водой Р. Объект помещают на предметное стекло, препаровальными иглами отделяют кожуру семени или ткани околоплодника и рассматривают их в растворе хлоралгидрата Р1 или растворе глицерина Р. Срезы. Для приготовления срезов сухие плоды и семена предварительно размягчают, поместив их на сутки во влажную камеру (влажной камерой служит эксикатор с водой, в которую добавлено несколько капель хлороформа) или водяным паром в течение 15—30 мин или более в зависимости от твердости объекта. Мелкие плоды и семена запаивают в парафиновый блок размером около 0,5 см х о,5 см * 1,5 см. Кончиком нагретой препаровальной иглы расплавляют парафин и в образовавшуюся^ яйку быстро погружают объект. Поверхность объекта должна быть сухой. Срезы объекта делают вместе с парг-фином; срезы выбирают из парафина препасс-вальной иглой, смоченной жидкостью, и готс-вят микропрепараты в растворе глицерина ~ или растворе хлоралгидрата Р1. Диагностические признаки: форма и стрг-ение клетокэкзокарпия (эпидермиса), наличие и строение трихом, расположение и форме механических элементов в мезокарпии, числе и расположение эфиро-масличных каналов проводящих пучков, наличие кристаллически! включений. Исследование при дополнительном измельчении. Препарат готовят так же, как указано в разделе «Листья, травы, цветки». ЖОРА Цельное сырье и измельченное сырье. Готовят поперечные или продольные срезы коры. Кусочки коры размером ок 2—3 см х 0,5—1 см кипятят в колбе или пробирке с водой Р в течение 5 мин. Размягчен ные куски выравнивают скальпелем так, чтобь они имели строго'поперечное или продольное сечение. Делают срезы и готовят микропрегз-раты в растворе хлоралгидрата Р1 или растворе глицерина Р. При необходимости готс-вят препараты в соответствующих реактива: для выявления различных структур или веществ. Диагностические признаки: толщина окраска и характер пробки, наличие колле— химы, толщина первичной и вторичной корь ширина сердцевинных лучей, особенное^» расположения и количество лубяных волоко каменистых клеток, клеток с эфирным маслом включения кристаллов оксалата кальция млечники. Соскоб коры или мелкие кусочки кипятя-в течение 3—5 мин в растворе 50 г/л натр„~ гидроксида Р, промывают водой Р и готову микропрепараты, раздавливая объект скаль пелем в растворе глицерина Р или раствор? хлоралгидрата Р1. Исследование при дополнительном измельчении. Препарат готовят так же, как указано в разделе «Листья, травы, цветки». #КОРНИ, КОРНЕВИЩА, КЛУБНИ, ЛУКОВИЦЫ, КЛУБНЕЛУКОВИЦЫ Цельное сырье. Готовят поперечные * продольные срезы. Небольшие куски полэе*-ных органов помещают в холодную во<Э> р * выдерживают около суток, затем помешашшг в смесь спирт Р — глицерин Р (1:1. сбою на 3 сут. Размоченные объекты выравнивак-скальпелем так, чтобы они имели строго! •»-• перечное или продольное сечение. Дегшиг срезы и готовят микропрепараты в растворе хлоралгидрата Р1 или растворе гт/церипа Р 2. 8.23. Макроскопический и микроскопический анализ лекарственного
рассматривают диагностические признаки сначала при малом, затем лри большом увеличении. Диагностические признаки; особенности строения эпидермы или перидермы, расположение и строение механических, проводящих, секреторных тканей, кристаллы оксалата кальция, запасные вещества. Измельченное сырье. Кусочки подземных органов кипятят в течение 3—5 мин е растворе 50 г/л натрия гидроксида Рг тщательно промывают водой Р и готовят микропрепара- ты, раздавливая куши t домодв адщш- на Р или растворе хлоралгидрата РЬ,-,.-. Исследование при дололнител ьном из- мельчении Препарат готовят так щ щу^- швраш«/1шя, МИКРОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Микрохимический анализ может проводиться одновременно с микроскопическим анализом., Крахмал. Готовят два препарата —в /аас- meope Люголя Р и в воде F; от йода крахмаль ныб зерна окрашиваются в синий цвет. Введе определяют их форму, строение. Также для идентификации зерен крахмала проводят испытание в поляризованном свете (между перекрестными призмами Онколя) — на зернах обнаруживается черный крестик. Жирное и эфирное масло. Для обнаружения жирного и эфирного масла готовят препарат в растворе Судана /// Р и подогревают; капли жирного или эфирного масла окрашиваются в оранжево-розовый цвет. Слизь. Для обнаружения слизи готовят препарат порошка в растворе черной туши Р и тотчас рассматривают под микроскопом (малое увеличение); слизь заметна в виде бесцветных масс на черном фоне. Либо помещают 2 капли раствора рутения красного Р на предметное стекло, небольшое количество порошка суспендируют в жидкости и накрывают покровным стеклом, через 1 мин дают впитаться капле воды дистиллированной Р между предметным и покровным стеклами; слизь окрашивается в фиолетово-красный цвет. Одревесневшие (лигнифицированные) элементы. Небольшое количество порошка помещают на предметное стекло, прибавляют 1—2 капли 10 % (об/об) спиртового раствора флороглюцина Р, перемешивают и выдерживают до почти полного испарения растворителя, прибавляют 1—2 капли кислоты хлористоводородной Р, накрывают препарат покровным стеклом и немедленна, пробма-тривают под микроскопом; красное окрашивание указывает на присутствие лигнина. Для пользовать также раствор 10 г/л сафранина Р. Срезы помещают в раствор 10 г/л сафранина Р в спирте (50 % об/об) Р на 30 мин (в закрытом бюксе или на асовом стекле), промывают сначала спиртом (50 % об/об) Р, затем подкисленным спиртом (на 100 мл 96 % спирта Р прибавляют 2 капли хлористоводородной кислоты Р) и заключают на предметном стекле в глицерин Р; одревесневшие оболочки окрашиваются в красный цвет. Дубильные вещества. Наличие дубильных веществ устанавливают, нанося 1 каплю раствора 10 г/л желез* (lit) аммония сульфа- ш Р или рашра 30 г/л жтю (III) да Р на внутреннюю поверхность сухой коры; появляется.черно-синее или черно-зеленое окрашивание.
Производные энтр^нв, изводныханщенаогрделщ капли растре 50 г/л ш«№я dufamk P на внутреннюю поверхность коры (красное окрашивание) или проводя микросублимацию описанным ниже способом. На предмет- ное стекло ставят трубку диаметром 1,5 см и высотой 2 см. Внутрь стеклянной трубки ло- мещают небольшое количество порошка (или соскоба) испытуемого образца, сверху накрывают другим предметным стеклом, ставят на асбестовую сетку, закрепленную в штативе, и подогревают. Пламя горелки следует держать от предметного стекла на расстоянии 5 — 7 см. На ПОВбрХНбСТЬ СШЛа* №Т6ДОё служит для улавливания сублимата, помещают кусочки фильтровальной бумаги и смачивают время от времени холодной водой. Через некоторое время на нижней стороне стекла появляется налет. Под микроскопом в сублимате видны тонкие желтые иголочки, которые в ультрафиолетовом свете (люминесцентный микроскоп) имеют яркое желтое или оранжево-красное свечение. В растворе 50 г/л калия гидроксида Р в 96 % спирте Р сублимат растворяется с появлением красного окрашивания. Инулин. Для обнаружения инулина на предметное стекло помещают около 0,1 г порошка образца, 1 — 2 капли раствора р-нафтола Р1 (или раствора резорцина Р, или раствора тимола Р) и 1 каплю кислоты серной Р', появляется красновато-фиолетовое окрашивание (от резорцина — оранжево-красное). О наличии инулина можно делать выводы только при отсутствии крахмала. Использование сеа<тива молочной кислоты. Помещают 2 — 3 капли реактива молочной кислоты Р на предметное стекло, небольшое количество порошка суспендируют в жидкости, накрывают покровным сте'-клом, препарат очень аккуратно нагревают на плитке или на газовой микрогорелке до ки- ия и кипя~" з течение непродолжительного времени, при необходимости с помо- Государственная фармакопея Республики Белар**
и просматривают под микроскопом. Лигнифи-цированные структуры окрашиваются в ярко-желтый цвет; структуры, содержащие целлюлозу, остаются бесцветными. Зерна крахмала окрашиваются в более или менее насыщенный фиолетовый цвет; некоторые секреты (например, эфирные масла, смолы) окрашиваются в оранжевый цвет; пробка окрашивается в красный цвет. ^ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ Метод люминесцентной микроскопии применяется (где это целесообразно) для определения подлинности лекарственного растительного сырья. Преимуществом метода является возможность его применения для изучения сухого растительного материала, из которого готовят толстые срезы или препараты порошка и рассматривают их в падающем свете при освещении препарата сверху через опак-иллюминатор или объектив. Люминесцентная микроскопия выполняется с помощью люминесцентных микроскопов, снабженных специальными люминесцентными осветителями.
|
