Иммунологический скринингЕсли клонированный ген экспрессируется, то его продукт – весь белок или часть – можно обнаружить иммунологическими методами (рис. 52).
Рис. 52. Скрининг клонов трансформированных клеток E.coli с помощью специфических антител 1-6 – этапы эксперимента (описание см. в тексте)
1. Клетки из каждой выросшей колонии переносят на твердую подложку. 2. Осуществляют лизис клеток и клеточные белки фиксируют на фильтре. 3. Фильтр помещают в раствор, содержащий первые антитела (АТ), которые специфично связываются (преципитируют) только с искомым белком. 4. Несвязавшиеся первые АТ удаляют, наносят на фильтр вторые АТ, специфичные в отношении первых, связанные с ферментом (например, щелочной фосфатазой). 5. Отмывают фильтр от несвязавшихся вторых АТ и помещают в раствор, содержащий субстрат для фермента, при гидролизе которого образуется окрашенный продукт. Гидролиз может произойти только в присутствии вторых антител, к которым присоединен фермент. Таким образом, окрашенные пятна на фильтре будут соответствовать колониям клеток, в которых происходит синтез специфичного белка, т.е. клеткам-трансформантам. 6. Отбирают колонии на чашке, соответствующие окрашенным пятнам на фильтре, и культивируют их. В них может содержаться рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, гомологичный первым АТ. Скрининг по активности белка Метод гибридизации ДНК и иммунологические методы позволяют идентифицировать многие гены и их продукты. Если при этом искомый ген кодирует фермент, не синтезируемый клеткой-хозяином, то для обнаружения клонов, содержащих данный ген, можно использовать метод идентификации на чашках, основанный на выявлении активности белка – продукта детектируемого гена. Для этого клоны Е. соli, составляющие геномную библиотеку изучаемых организмов, высевают на чашках с питательной средой, содержащей специфический субстрат. После окрашивания селективным красителем клетки, способные утилизировать этот субстрат, приобретали специфическую окраску. Если искомый ген кодирует продукт, без которого мутантная клетка-хозяин не может расти на минимальной среде, то библиотеку можно создать методом трансформации мутантных клеток. Клетки, выросшие в отсутствие необходимого субстрата на минимальной среде, обязательно содержат функциональный искомый ген, попавший в клетку в составе плазмидного вектора.
|
