Работа с клеточными культурами

Вирусологический метод

Вирусологическая диагностика — основана на выделении из исследуемого материала вируса и его последующей идентификации.

Вирусы в отличие от бактерий размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вирусов может осуществляться на уровне организма подопытного животного (куриный эмбрион как развивающийся организм относят к подопытным животным) или живой клетки, выращиваемой вне организма, т.е. на уровне культуры клеток.

Работа с клеточными культурами

Как известно, вирусы являются генетическими внутриклеточными паразитами, способными к размножению только в живых системах. Следовательно, первым этапом вирусологической диагностики является получение и подготовка одной из живых систем: культур клеток, куриных эмбрионов или чувствительных лабораторных животных. Наиболее трудоемкой является работа с клеточными культурами, на которой следует остановиться подробнее.

На практике используют первичные, полуперевиваемые (диплоидные) и перевиваемые клеточные культуры.

Первичные клеточные культуры. Эти культуры получают непосредственно из ткани животного или человека путем разрушения протеолитическими ферментами (трипсин, коллагеназа, проназа) межклеточного вещества. Разобщенные (диспергированные) клетки, помещенные в питательную среду, способны прикрепляться к поверхности культурального сосуда и размножаться, образуя так называемый монослой – слой толщиной в одну клетку. С помощью специальных реактивов (трипсина, версена) клетки можно снять с поверхности одного сосуда и пересадить в другой. Такая манипуляция называется пассажем. Поскольку первичные культуры получают из уже сформировавшихся, высокодифференцированных клеток, их способность к делению и размножению ограниченна. Первичные культуры выдерживают от 5 до 10 пассажей.

Первичные клеточные культуры готовят из любой эмбриональной ткани животных и человека, поскольку эмбриональные клетки обладают повышенной способностью к росту и размножению. Чаще культуры клеток готовят из смеси нескольких тканей, например кожной, костной и мышечной. Так получают фибробласты эмбриона человека (ФЭЧ) и кур (КФ), клетки почек человека (КПЧ) и др. Для получения клеточных культур используют эмбриональную ткань человека (в случае прерывания беременности), а также 8-12-дневные куриные эмбрионы.

Культивирование клеток осуществляют в стеклянных или пластмассовых сосудах различной формы и размера, желательно одноразового пользования, при строгом соблюдении асептики на всех этапах.

Приготовление клеточной взвеси. Ткань, доставленную в лабораторию, отмывают от крови, жировых компонентов, клеточного детрита и других примесей в растворе Хенкса или фосфатного буфера с антибиотиками, измельчают ножницами и продолжают отмывать до полной прозрачности раствора. Затем ее заливают трипсином (на 100 г ткани – от 200 мл до 300 мл раствора трипсина) и диспергируют при помощи магнитной мешалки или пипетированием. Надосадочную жидкость, содержащую трипсинизированные клетки, сливают и помещают в холодильник при 4 °С.

Трипсинизацию повторяют несколько раз. Взвесь клеток центрифугируют при 600 об/мин в течение от 5 до 10 мин, ресуспендируют в питательной среде и окрашивают фуксином, метиленовой синью или другими красителями, а затем определяют их концентрацию в камере Горяева. Клеточную взвесь разводят питательной средой до концентрации от 4 ´ 10⁵ до 8 ´ 10⁵ клеток в 1 мл, разливают в культуральные сосуды, плотно закрывают резиновыми пробками и культивируют в термостате при температуре от 35 °С до 37 °С в течение времени от 48 до 96 ч (пробирки кладут под углом 5°), после чего отбирают культуры с хорошо сформировавшимся монослоем.

Пассирование клеточных культур. Во флаконы с клетками после отсасывания питательной среды наливают подогретый до 37 °С раствор 0,25 %-го трипсина или 0,02 %-го версена и помещают их на промежуток времени от 3 до 5 мин в термостат. Затем версен или трипсин удаляют, в культуральный сосуд добавляют небольшое количество питательной среды и, интенсивно взбалтывая, добиваются суспензирования клеток в питательной среде. После этого подсчитывают количество клеток, доводят их до необходимой концентрации и разливают в новые флаконы.

Перевиваемые (пассажные) клеточные культуры. Такие культуры способны выдерживать неограниченное число пассажей. Они происходят из опухолевых клеток, утративших дифференциацию, и не имеющих ограничений роста. Перевиваемые (стабильные) клеточные культуры получены из разнообразных нормальных и опухолевых тканей человека: амниона (А-0, АЛ, FL), почек (Rh, ППЧ), карциномы шейки матки (HeLa), раковой опухоли гортани (НЕр-2), костного мозга больного раком легких (Detroit), рабдомиосаркомы эмбриона человека (RD) и др.

Клетки перевиваемых линий сохраняют замороженными в жидком азоте, при необходимости их оттаивают и используют для исследований.

Помимо стационарного способа культивирования с регулярными пассажами, описанного выше для первичных культур, для большинства перевиваемых клеточных культур возможно применение метода суспензионных культур, при котором клетки находятся в жидкой среде во взвешенном состоянии. Модификацией данного метода является проточное культивирование, при котором в специальный аппарат (ферментер или роллерный культиватор) непрерывно добавляют свежую питательную среду и удаляют отработанную. Подобный метод позволяет в любой момент получить значительные количества клеточной массы для культивирования вирусов; он применяется, как правило, в крупных лабораториях или при промышленном производстве вакцин.

Полуперевиваемые (диплоидные) культуры. В результате нескольких последовательных пассажей иногда формируется так называемая диплоидная культура – популяция фибробластоподобных клеток, которые способны к быстрому размножению, выдерживают от 30 до 60 пассажей и сохраняют исходный набор хромосом. Диплоидные клетки человека высокочувствительны к ряду вирусов и широко используются в вирусологии, занимая промежуточное положение между первичными и перевиваемыми клеточными культурами.

Получены культуры диплоидных клеток человека (PW-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90 и др.), а также коровы, свиньи, овцы, ягненка.

Питательные среды для культур клеток. В составе этих сред имеется полный набор аминокислот, витамины, ростовые факторы. Наряду с сухими средами и отдельными компонентами выпускают готовые жидкие среды (199, Игла, гидролизат лактальбумина, сухие среды и концентраты), которые перед использованием обычно разводят в воде.

Культуральные среды делят на ростовые и поддерживающие. Для выращивания клеточных культур применяются ростовые среды, обогащенные сыворотками животных и человека, например бычья сыворотка, фетальная (эмбриональная) коровья сыворотка и др. Количество сыворотки в питательной среде обычно составляет от 2 % до 30 % и зависит от свойств культуры клеток и состава среды.

Поддерживающие среды. Их применяют для сохранения выросших монослоев клеток после заражения их вирусами. Эти среды содержат меньшее количество сыворотки или добавляются к культуре без нее. Перед использованием среды в нее вносят антибиотики для предотвращения роста случайно попавших микроорганизмов. Культуральные среды стерилизуют, а при наличии нестабильных компонентов – фильтруют. Оптимальные значения рН питательных сред (от 7,2 до 7,6) поддерживают с помощью буферных систем (чаще всего используют бикарбонатный буфер). В среды добавляют индикатор феноловый красный, который становится оранжево-желтым при закислении и малиновым при защелачивании среды.

Культивирование клеток вне организма требует выполнения ряда условий. Одним из них является строгое соблюдение стерильности при работе, т.к. используемые питательные среды служат отличным питательным субстратом также для бактерий и грибов. Клетки тканей обладают весьма высокой чувствительностью к солям тяжелых металлов. Поэтому необходимо придавать исключительное значение качеству различных ингредиентов, входящих в состав солевых растворов и питательных сред, а также способам обработки посуды и резиновых пробок, применяемых при культивировании клеток.

Одним из обязательных условий успешной работы с клетками является высокое качество дистиллированной воды (проверяется 2 раза в неделю). Для работы с клетками используют бидистиллированную или деионизированную воду. Лучшими дистилляторами являются приборы из стекла или легированной стали: из такой аппаратуры не вымываются ионы тяжелых металлов, являющиеся токсичными для клеток. Деионизированную воду получают на специальных установках, где очистка воды от солей осуществляется при ее последовательном прохождении через колонки с анионитом и катионитом.

При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют к подготовке и стерилизации посуды и пробок. Во многих случаях именно неправильные их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой дегенерации клеточного монослоя. Обработка стеклянной посуды для культур клеток состоит из нескольких этапов.

1 Тщательное мытье с помощью ерша в горячей воде нейтральным моющим средством.

2 Многократное промывание (с трехкратной сменой) дистиллированной водой.

3 Сушка в сушильном шкафу при температуре от 80 °С до 100 °С.

4 Матрацы для культивирования клеток закрывают фольгой или бумагой; пипетки с тупого конца закрывают ватой, обёртывают бумагой и укладывают в металлические пеналы по 10 или 30 шт. Пробирки закрывают фольгой, укладывая в пачки по 10 шт., и заворачивают в бумагу. Чашки Петри обёртывают бумагой по 1, 2, 3 шт. Стеклянную посуду стерилизуют сухим жаром от 3 до 4 ч при 180 °С в сухожаровом шкафу.

Новую стеклянную посуду моют теплой водой с моющим порошком, ополаскивают раствором хромпика, тщательно промывают водопроводной водой в течение 15 мин. После этого обрабатывают посуду по приведенной методике.

Использованную посуду автоклавируют при 130 °С в течение 30 мин, затем заливают на 24 ч 5 % раствором хлорамина. Затем промывают не менее 3 раз водопроводной водой и обрабатывают по приведенной ранее методике.

Металлические инструменты моют в горячей воде с мылом, промывают водопроводной и дистиллированной водой. Стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 30 мин. Во время работы в стерильном боксе металлические инструменты держат в стакане с 96 % этиловым спиртом, перед использованием обжигают. Новые резиновые пробки кипятят в 2 % растворе соды в течение 30 мин и 5 раз промывают водопроводной водой, дважды повторяя кипячение и промывку. Затем кипятят 30 мин в дистиллированной воде, сушат при комнатной температуре, укладывают в пачки, стерилизуют в паровом стерилизаторе.

Пробки, бывшие в употреблении, кипятят 30 мин в водопроводной воде с нейтральным порошком, промывают водопроводной и дистиллированной водой, затем кипятят в дистиллированной воде 30 мин и обрабатывают по приведенной методике.

Для роста и размножения клеток вне организма необходим сложный комплекс физико-химических факторов: определенная температура, концентрация водородных ионов, неорганические соединения, углеводы, аминокислоты, белки, витамины, кислород и углекислота. Чтобы обеспечить все эти требования для культивирования вирусов в культурах клеток, используют сложные по составу питательные среды. По характеру компонентов, входящих в их состав, эти среды делят на две группы.

1 Среды, представляющие смеси солевых растворов (Хенкса, Эрла и др.) и естественных компонентов (сыворотка крови животных и человека, гидролизат альбумина). Количество каждого из этих компонентов в разных прописях сред значительно варьирует.

2 Синтетические и полусинтетические среды, состоящие из солевых растворов (Эрла, Хенкса и др.) с добавлением аминокислот, витаминов, коэнзимов и нуклеотидов (среды Игла, 199 и др.). В синтетических средах клетки могут существовать в жизнеспособном состоянии непродолжительное время (до 7 дней). Для более длительного поддержания их в жизнеспособном состоянии, а также для создания лучших условий роста и размножения клеток к синтетическим средам добавляют сыворотку животных (коров, телят и др.).

Для выделения вирусов могут быть использованы разные методы культивирования клеток вне организма. Однако в настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоскостенных сосудах-матрацах вместимостью 1 л, 250 мл и 100 мл или в обычных бактериологических пробирках, обработанных соответствующим способом.

При использовании первично-трипсинизированных культур клеток сущность метода заключается в разрушении межклеточных связей в тканях протеолитическими ферментами и разобщении клеток для выращивания монослоя на поверхности стекла. Источником получения клеток могут служить ткани и органы эмбрионов человека и животных, забитых животных и птиц, а также извлеченные у человека при операции. Используют нормальные и злокачественные перерожденные ткани, эпителиальные, фибробластического типа и смешанные. Способность к размножению клеток, извлеченных из организма, тесно связана со степенью дифференциации ткани. Чем меньше дифференцирована ткань, тем более интенсивной способностью пролиферации обладают ее клетки in vitro. Поэтому клетки эмбриональных и опухолевых тканей значительно легче культивировать вне организма, чем нормальные клетки взрослых животных. Схема получения культуры клеток из куриных эмбрионов представлена на рисунке 1.

Ткань, подготовленную к трипсинизации, переносят в чашку Петри и в асептических условиях измельчают ножницами до размера от 2 мм до 4 мм. Кусочки тщательно отмывают от крови солевым раствором и пинцетом переносят в колбу для трипсинизации. Наибольший выход жизнеспособных клеток при диспергировании тканей дает трипсин в 0,25 % концентрации. Кусочки ткани в колбе заливают двойным объемом 0,25 % раствора трипсина, подогретого до температуры от 32 °С до 37 °С, и помещают в термостат. Ткани взрослых животных инкубируют при 37 °С – 30 мин, эмбрионов – 10 мин. Во время инкубации ткань периодически перемешивают путем вращения колбы. Надосадочную жидкость, содержащую взвесь клеток, отсасывают в центрифужные пробирки, а ткань заливают повой порцией трипсина. Дробную трипсинизацию проводят до полного истощения ткани, о чем судят по прозрачности надосадочной жидкости. Собранные порции надосадочной жидкости центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток однократно отмывают солевым раствором. Взвесь клеток контролируют на стерильность путем посева по 0,1 мл в пробирки с сахарным бульоном. Затем подсчитывают клетки в камере Горяева. После подсчета взвесь клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от 2 ´ 10⁵ до 3 ´ 10⁵ клеток, и разливают в пробирки от 1 мл до 1,5 мл; в матрацы, вместимостью 1 л, 250 мл и 100 мл, вносят соответственно 100 мл, 40 мл и 15 мл взвеси клеток.

1 – извлечение эмбриона; 2 – отсечение головы, измельчение; 3– многократное промывание; 4 – трипсинизация; 5– объединение взвеси клеток в сосуде на тающем льду; 6 – центрифугирование и удаление трипсина; 7 – ресуспензирование осадка в небольшом количестве среды, подсчет; 8 – доведение до нужной концентрации; 9 – посев клеток в сосуды; 10 – термостатирование.

Рисунок 1 – Схема получения культуры клеток

 

Пробирки и матрацы с суспензией клеток плотно закрывают резиновыми пробками (для предупреждения улетучивания СО, и защелачивания среды) и помешают в термостат при 37 °С. Матрацы располагают в горизонтальном положении, а пробирки укладывают на лотки или специальные подставки под углом от 5° до 10°.

Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Если клетки не пролиферируют, они выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, это свидетельствует о плохой обработке посуды или токсичности ингредиентов питательной среды.

Наряду с первично-трипсинизированными тканями, для культивирования вирусов широко используют культуры перевиваемых клеток, т.е. культуры клеток, способных к размножению вне организма неопределенно длительное время. Наиболее часто применяют культуры клеток, полученные из нормальных и раковых тканей человека. Широкую известность приобрела линия клеток HeLa, полученная из опухоли шейки матки, Нер-2 – из карциономы гортани, KB – из ткани рака полости рта. Готовят такие культуры клеток и из нормальных тканей животных – почки обезьяны, кролика и эмбриона свиньи.

Для пересева перевиваемых клеток питательную среду отсасывают пипеткой и выливают. Сформировавшийся тонкий слой клеток разрушают 0,25 % раствором трипсина или 0,02 % раствором версена и освобожденные таким образом клетки переносят в новый сосуд со свежим питательным раствором, где вновь образуется монослой клеток.