Нормально-фазовая и обращенно-фазовая ВЭЖХ

Для неионизированных соединений, или ионизация которых может быть легко подавлена, используют НФ и ОФ ВЭЖХ. В этих методах удерживание и разделение веществ зависит от их полярности. Оценка полярности вещества сложная задача.

На практике достаточно удобной является условная оценка полярности,основанная на шкале упрощенного критерия гидрофобности Н. Эта характеристика вещества учитывает относительное количество полярных и неполярных структурных фрагментов, содержащихся в молекуле, и может быть оценена по формуле:

Н = n_Н -4 √n_f,

где n_Н - суммарное число атомов углерода и галогенов, n_f - число функциональных групп в молекуле вещества.

Чем больше Н, тем меньше полярность, выше гидрофобность (водоотталкивание). Данный критерий позволяет сравнить полярность аналогичных по структуре соединений. Легко заметить, что толуол менее полярен, чем бензол, а пропилбензол менее полярен, чем толуол, напротив, фенол более полярен, чем бензол.

В НФ ВЭЖХ подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная (силикагель, оксид алюминия, силикагель с привитыми полярными группами). Основной механизм удерживания – адсорбционный. Удерживание соединений происходит за счёт диполь-дипольных взаимодействий между полярными группами соединения и активных центров (тоже полярных) на поверхности адсорбента. Подвижной фазой обычно служит н -гексан с добавками более полярных растворителей: спиртов, хлороформа, хлористого метилена, толуола, эфиров (этилацетат). Чем полярнее молекула соединения, тем больше ее сродство к неподвижной фазе и время удерживания. Порядок элюирования некоторых соединений показан на рис.1.

Рис. 1. Ряды элюирования в нормально-фазовой ВЭЖХ.

Для уменьшения времени удерживания вещества в подвижную фазу вводят более полярные растворители и увеличивают их содержание. Например, при разделении бензола, нафталина и антрацена при элюировании подвижными фазами 5 и 10 % изопропанола время удерживания соединений во втором случае будет меньше.

В ОФ ВЭЖХ неподвижная фаза – неполярна (обычно силикагель с привитыми углеводородными радикалами), а подвижная фаза – более полярна. Основной механизм распределительный (между подвижной фазой и «псевдожидкой» фазой на поверхности модифицированного силикагеля) Удерживание соединений происходит за счёт гидрофобных взаимодействий между молекулами вещества и углеводородными «хвостами» на поверхности модифицированного силикагеля

В качестве подвижной фазы используют смеси полярных органических растворителей (ацетонитрила, метанола, изо-пропанола) с водой. Чем гидрофобнее (менее полярна) молекула, тем больше ее сродство к неподвижной фазе и время удерживания. Эту закономерность иллюстрируют ряды элюивания, приведенные на рис.2.

Рис.2. Ряды элюирования соединений в обращенно-фазовой ВЭЖХ

 

Для уменьшения времени удерживания вещества повышают элюирующую способность подвижной фазы, для чего вводят органические растворители (они менее полярны, чем вода) и увеличивают их содержание. На рис.3 показано, что при уменьшении содержания ацетонитрила в подвижной фазе время удерживания разделяемых соединений растет, увеличивается и различия в удерживании (селективность).

На время удерживания веществ влияет природа неподвижной фазы. При увеличении размера углеводородных радикалов, химически привитых на поверхность силикагеля, увеличивается гидрофобность сорбента, и неполярные вещества удерживаются сильнее (рис. 4).

Рис.3. Удерживание веществ в ОФ ВЭЖХ в зависимости от соотношения
ацетонитрил-вода в подвижной фазе

Рис.4. Зависимость удерживания веществ в ОФ ВЭЖХ от длины привитого радикала на поверхности силикагеля

Следует отметить, что многие органические вещества со средней полярностью можно разделять как НФ ВЭЖХ, так и ОФ ВЭЖХ. Силикагель (НФХ) селективнее при разделении изомеров (о, м, п), а также сорбатов, различающихся по функциональности (производные бензола, фенола и т.д.). При разделении гомологов (например, спиртов, карбоновых кислот с различным по величине углеводородным скелетом) лучше применять алкилсиликагели (ОФХ). Если в анализируемой смеси предполагаются компоненты разной химической природы: витамины, лекарства, наркотики, токсины, гормоны начинать разработку метода лучше с ОФ ВЭЖХ.