Подготовка и проведение работыКаждой паре учеников потребуется 12 пробирок для сбора фракций. Пусть они пронумеруют свои пробирки цифрами от 1 до 10. Оставшиеся две нужно подписать «Слив» и «Буфер». Пробирки нужно поставить в штатив. Или на штативе, или на пробирках, нужно написать также свои имена и класс. С помощью пипетки отлейте 4 мл буфера для хроматографии в пробирку, подписанную «Буфер». В этом наборе дается всего одна стоковая банка с буфером. Вы можете либо сами отлить по 4 мл буфера каждой паре, либо пусть это сделает один из учеников в паре. Ученики должны снять верхнюю крышку с колонки и отломить нижнюю пробку. Излишек буфера, в котором хранилась колонка, нужно слить в пробирку с надписью «Слив». Затем необходимо закрыть нижнюю часть колонки предоставляемой крышкой. Поместите колонку в пробирку для сбора фракций 1. Теперь ученики готовы нанести образец (смесь белков) на колонку (или это может сделать учитель). Так как флакон со смесью белков всего один, то может быть, наиболее удобно подойти к каждой паре и нанести образец самому (см. ниже). Пусть ваши ученики снимут крышку, закрывающую нижнюю часть колонки. Пронаблюдайте, как выглядит верхний слой сорбента, после того, как из него вытек буфер. Можно увидеть «зернистую» структуру сорбента. Если сверху останется буфер, то смесь белков разбавится при нанесении, что приведет к ухудшению разделения из-за диффузии. Осторожно нанесите одну каплю смеси белков на поверхность сорбента. Засуньте пипетку внутрь колонки и аккуратно капните, не повредив поверхность геля. Дайте образцу время, чтобы войти в гель. Затем осторожно (по стенке) добавьте 250 мкл буфера. Вытекающая из колонки жидкость будет собираться в пробирку 1. Когда вся жидкость из колонки вытечет, добавьте еще 250 мкл буфера. Также собирайте вытекающую жидкость в пробирку 1. Когда вся жидкость вытечет, нанесите на колонку 3 мл буфера. Это можно сделать последовательно нанеся три раза по 1 мл. Образец уже зашел достаточно далеко внутрь сорбента, так что легкое взмучивание поверхности не ухудшит разделение. Поместите колонку в пробирку 2, и начните считать капли, вытекающие из колонки. Соберите 5 капель в пробирку 2, поместите колонку в пробирку 3 и соберите в нее следующие 5, и.т.п пока не дойдете до 10й пробирки. В пробирку 10 соберите 10 капель. После этого опять закройте колонку крышкой. Можно предложить ученикам разделиться: пока один перемещает колонку, другой считает капли. Собранные фракции можно хранить в холодильнике, закрыв пробирки крышками или замотав пищевой пленкой. В таком виде они могут простоять примерно неделю. Аналогично неделю может простоять колонка, если закрыть ее крышками сверху и снизу. Ученикам может быть интересно сравнить исходную смесь белков с их собранными фракциями. Вы можете взять оставшийся буфер и добавить в него ~5 капель смеси белков. Затем откапайте по 5 капель полученного раствора в пробирки «Слив» ваших учеников. Таким образом, ученики смогут сравнить исходный и разделенный по размеру образцы. Схема эксперимента (Краткое руководство по выполнению лабораторной работы) 1.
2. Снимите верхнюю крышку с колонки для хроматографии и отломите нижнюю. Дайте всей лишней жидкости стечь в пробирку «Слив». Пронаблюдайте за верхним слоем сорбента и убедитесь, что весь буфер вошел в колонку. Вы должны увидеть зернистую структуру сорбента. Закройте колонку снизу крышкой, чтобы она не пересохла.
3.
4. Непосредственно перед нанесением образца, откройте нижнюю часть колонки. Во избежание пересыхания, не надо открывать ее раньше времени. С помощью пипетки, нанесите одну каплю раствора белков на поверхность сорбента (возможно, ваш учитель предпочтет сделать это за вас). Важно поместить пипетку прямо над поверхностью геля и аккуратно капнуть одну каплю, чтобы минимально повредить (взбаламутить) гель.
5.
6. Таким же образом добавьте еще 250 мкл буфера. Продолжайте собирать капли в пробирку «1». 7. Нанесите на колонку 3 мл буфера. Это можно сделать, последовательно нанеся три раза по 1 мл. К этому моменту образец уже достаточно далеко зашел в гель, для того, чтобы легкое повреждение поверхности сорбента не повлияло на качество разделения. Перенесите колонку в пробирку с цифрой «2» и начните считать вытекающие из колонки капли. Соберите 5 капель в пробирку «2».
9. Собирайте по 5 капель в каждую пробирку, пока не дойдете до десятой. В нее соберите 10 капель. Закройте колонку крышками сверху и снизу, и закройте пробирки с собранными фракциями пленкой или накройте их (если ваш учитель скажет вам так сделать). Поставьте пробирки с собранными фракциями в холодильник до следующего урока. Зарисуйте или запишите полученные вами результаты.
Руководство для учеников Урок 1
|
Возьмите 12 пробирок для сбора фракций и подпишите их последовательно цифрами от 1 до 10. Подпишите также на них ваши имена и класс. Последние две пробирки подпишите «Слив» и «Буфер». Чистой пипеткой перенесите 4 мл буфера для хроматографии в пробирку с надписью «Буфер».
Аккуратно перенесите колонку в пробирку «1». Теперь вы готовы к нанесению образца, состоящего из смеси белков, на колонку (возможно, это будет делать учитель сам).
Как только образец войдет в гель, нанесите сверху 250 мкл буфера. Чтобы разделение прошло хорошо, постарайтесь не повредить поверхность сорбента. Для этого очень аккуратно нанесите буфер по стенке колонки (см. рис.). Вытекающие из колонки капли будут составлять фракцию «1».
8. После того, как вы собрали 5 капель во вторую пробирку, перенесите колонку в пробирку номер «3». Собирайте по 5 капель в каждую пробирку, после чего переносите колонку в следующую.
