Лабораторный практикум
Составитель: Маклаков Сергей Анатольевич
Редактор Асташова Е.М.
Лицензия ЛР № 02 07 14 от 02.02.98г. Подписано в печать.0.2007. Формат 60´84 1/16. Бумага типографская №2. Отпечатано на ризографе. Усл. печ. л. ____. Уч.- изд. л ____. Тираж 100 экз. Заказ №
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева. Новомосковский институт. Издательский центр Адрес университета: 125047, Москва, Мииусская пл., 9 Адрес института: 301670 Новомосковск, Тульской обл., Дружбы, д.8 Содержание Раздела 4. Достижения и перспективы развития молекулярной биотехнологии Тема 1. Стратегические направления развития молекулярной биотехнологии 1. Цели и возможности генетической инженерии как стратегического направления молекулярной биотехнологии. 2. Связь молекулярной биотехнологии с другими науками, научными направлениями и промышленными производствами. 3. Молекулярная биотехнология – путь к созданию новых продуцентов белковых веществ, первичных и вторичных метаболитов как целевых биотехнологических продуктов 4. Трансгенные растения – путь к повышению урожайности сельскохозяйственных культур. 5. Трансгенные организмы как биореакторы для производства белковых продуктов, антибиотиков, вакцин и других препаратов для народнохозяйственных нужд. 6. Этические проблемы генетической инженерии. Тема 2. Основные этапы технологии рекомбинантных ДНК Молекулярно-генетические основы технологии рекомбинантных ДНК 1. Строение генов прокариот и эукариот. 2. Подвижные генетические элементы: транспозоны. 3. Внехромосомные генетические элементы: плазмиды и бактериофаги. 4. Генетическая рекомбинация 5. Определение нуклеотидной последовательности: метод секвенирования ДНК по Сенгеру.
Матричный синтез ДНК и РНК. Методы амплификации и установления первичной структуры ДНК 1. Комплементарность нуклеиновых оснований. 2. Репликация ДНК. 3. Биосинтез РНК (транскрипция). Сплайсинг. 4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Основные этапы биосинтеза белка 1. Компоненты белоксинтезирующей системы. 2. Роль рибосом в синтезе белка. 3. Генетический код. 4. Трансляция: инициация, элонгация, терминация. 5. Котрансляционные модификации белка (процессинг). 6. Регуляция экспрессии генов прокариот и эукариот (энхансеры).
2.4. Основы технологии рекомбинантных ДНК 1. Основной инструментарий генетической инженерии: ферменты, векторные молекулы, организмы-реципиенты. 2. Методы клонирования ДНК в бактериальных клетках. 3. Трансформация бактериальных клеток и отбор трансформантов. 4. Сущность процесса интеграции гена-мишени в хромосомную ДНК хозяина. 5. Системы экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных и эукариотических клетках Требования к структуре экспрессирующих векторов. 6. Химерные белки как фактор стабильности продукта экспрессии в клетке: конструирование и использование. 7. Репортерные гены: конструирование и использование.
Лабораторный практикум Виртуальная лабораторная работа «Выделение ДНК из растительного сырья» Виртуальная лабораторная работа «Электрофорез ДНК в агарозном геле»
Методические указания Индивидуальное задание включает вопросы о строении и свойствах нуклеиновых кислот, процессах матричного синтеза с их участием в клетках прокариот и эукариот. Для выполнения задания необходимо иметь представление о строении генов прокариот и эукариот, знать этапы биосинтеза белка и принципы, которые лежат в их основе. Задание включает вопросы изменчивости генома, изучение которой привело к разработке технологий генетической инженерии. Представление о создании рекомбинантных ДНК - векторных системах на основе плазмид и бактериофагов – позволяет разобраться в технологиях клонирования ДНК и получения рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки являются одной из основных целей биотехнологических процессов на основе генетической инженерии. Следует детально разобраться в сущности полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время это наиболее распространенный способ для установления наличия ГМО в пищевом сырье или продуктах питания. При решении задачи обратите внимание на необходимость иллюстрировать ответ схемой умножения копий ДНК в процессе ПЦР. Для решения задач по матричному синтезу нуклеиновых кислот и биосинтезу белка рекомендуется запомнить несколько простых правил: 1. Репликация ДНК: Комплементарная цепь ДНК всегда синтезируется в направлении 5’ ®3’. В начале репликации фермент праймаза синтезирует короткую РНК-последовательность, комплементарную к матричной ДНК, которая автоматически удаляется, благодаря экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. 2. Транскрипция: РНК синтезируется на матричной цепи ДНК в направлении 5’®3’. В РНК тимин (T) заменяется на урацил (U) 3. Трансляция: Рибосомы двигаются вдоль мРНК в направлении 5'®3'. Индивидуальное задание выполняется по одному из нижеприведенных вариантов, выбор которого определяется последней цифрой номера зачетной книжки (шифра). Ответы на поставленные вопросы должны быть краткими, ясными и исчерпывающими и содержать обоснования излагаемых положений. Обязательным условием является написание необходимых химических формул, схем и рисунков. Не рекомендуется вклеивать ксерокопии рисунков и таблиц из учебников или сети Интернет. Выполненная индивидуальное задание дает право допуска к экзамену по дисциплине. При сдаче экзамена магистрант должен иметь ее при себе.
Варианты заданий Вариант 0. 1. В молекуле ДНК на долю цитозиновых нуклеотидов приходится 18%. Определить процентное содержание других нуклеотидов, входящих в молекулу ДНК. 2. Внесите необходимую информацию о механизме репликации ДНК эукариот в соответствующие колонки таблицы, содержащей перечень некоторых белков и ферментов, участвующих в процессе репликации Таблица
3. Что такое эндонуклеазы рестрикции II и почему они так важны для технологии рекомбинантных ДНК? 4. Перечислите наиболее важные свойства систем экспрессии клонированных генов. 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 4-х циклов ПЦР, если сначала имелись три копии фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 1. 1. В препаратах ДНК, выделенной из клеток туберкулезных бактерий, содержание аденина составило 15,1% от общего количества оснований. Определите примерное количество гуанина, тимина и цитозина в этой ДНК. 2. Определите возможное число информационных триплетов в участке молекулы ДНК, состоящем из 360 пар нуклеотидов, если молекула м-РНК содержит 300 нуклеотидов. 3. Опишите применение бактериофага λ в качестве вектора. Какими особенностями он обладает? 4. Какими способами можно влиять на экспрессию генов, клонированных в прокариотических организмах? 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 5-ти циклов ПЦР, если сначала имелись две копии фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 2. 1. Исследования показали, что 34% от общего числа нуклеотидов и-РНК приходится на гуанин, 18% - на урацил, 28% - на цитозин, 20% - на аденин. Определить процентный состав азотистых оснований двухцепочечной ДНК, слепком с которой является указанная и-РНК. 2. Определите характер возможных нарушений в функционировании лактозного оперона в случае мутации в операторе, что делает невозможным прикрепление к нему активного белка-репрессора, но при этом не нарушены функции РНК-полимеразы. 3. Что такое клонирование ДНК? Что необходимо для клонирования ДНК? 4. В чем состоят проблемы клонирования эукариотических генов в системе клеток прокариот. Опишите стратегию преодоления этих проблем. 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 5-ти циклов ПЦР, если сначала имелись три копии фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 3. 1. Участок молекулы белка имеет строение: про-лиз-гис-вал-тир. Сколько возможных вариантов строения фрагмента молекулы ДНК кодирует эту часть молекулы белка? 2. Используя таблицу генетического кода, составьте схему, демонстрирующую принцип колинеарности полинуклеотида (участка матричной РНК) и кодируемого им полипептида. На основе этой схемы проиллюстрируйте некоторые из принципов генетического кода (триплетность, неперекрываемость, непрерывность). 3. Каким образом осуществляют отбор колоний, содержащих рекомбинантную плазмиду? Приведите пример с применением плазмиды рBR322. 4. В чем состоят преимущества эукариотической системы экспрессии в сравнении с бактериальной? 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 4-х циклов ПЦР, если сначала имелись две копии фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 4. 1. Большая из двух цепей белка инсулина (цепь В) начинается со следующих аминокислот: фен-вал-асп-глу-гис-лей. Напишите последовательность нуклеотидов молекулы ДНК, хранящих информацию об этом участке белка. 2. Определите характер возможных нарушений в функционировании лактозного оперона в случае мутации в нуклеотидной последовательности промотора, узнаваемой РНК-полимеразой (исключает возможность специфического прикрепления этого фермента). 3. Что такое трансформация? Что означают понятия частота и эффективность трансформации? 4. Опишите основные общие и различные черты векторов для клонирования и экспрессии генов. 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 4-х циклов ПЦР, если сначала имелись четыре копии фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 5. 1. Участок гена имеет следующее строение: ЦГГ ЦГЦ ТЦА ААА ТЦГ... Укажите строение соответствующего участка того белка, информация о котором содержится в данном гене. Как отразится на строении белка удаление из гена 4-гo нуклеотида? 2. Определите характер возможных нарушений в функционировании лактозного оперона в случае мутации в гене-регуляторе, которая привела к стабильной инактивации белка-репрессора. 3. Опишите применение плазмиды pBR322 в качестве вектора. Какими особенностями она обладает? 4. Что означает понятие “регулируемый промотор”? Продемонстрируйте на примере. 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 5-ти циклов ПЦР, если сначала имелись четыре копии фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 6. 1. Объясните причину ситуации, при которой ген эукариотической клетки, занимающий участок ДНК размером в 2400 пар нуклеотидов, кодирует полипептид, состоящий из 180 аминокислотных остатков. 2. Антикодоны молекул т-РНК содержат следующие нуклеотиды: АГУ ГЦА ЦГУ УАГ ААА УУА... Определите последовательность аминокислот, доставляемых в рибосому данными молекулами т-РНК. 3. Какие существуют способы введения чужеродной ДНК в клетки E.coli? 4. Опишите условия встраивания гена интереса в хромосомную ДНК клетки-хозяина. 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 6-ти циклов ПЦР, если сначала имелись три копии фрагмента ДНК? Вариант 7. 1. Сложный белок состоит из четырёх полипептидных цепей, количество аминокислот в каждой из них: 116, 134, 162, 148. Какова длина оперона, кодирующего данный белок, если его регуляторная часть содержит 372 нуклеотида? Размер одного нуклеотида 0,34 нм. 2. Составьте схему прерывистой структуры гипотетического гена, состоящего из 5 экзонов и 4 интронов и кодирующего полипептид, включающий 300 аминокислотных остатков (относительные размеры отдельных экзонов и интронов можно выбрать произвольные). 3. В чем заключаются особенности клонирования больших фрагментов ДНК и какие векторы для этого применяют? 4. Какая стратегия используется при разработке получения рекомбинантных белков, чтобы сделать белки секретируемыми? 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 6-ти циклов ПЦР, если сначала имелись две копии фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 8. 1. Содержание нуклеотидов в цепи м-РНК составляет: цитозин – 20%, аденин – 25 %, урацил – 23 %, гуанин — 32%. Определите процентный состав нуклеотидов участка молекулы ДНК, являющейся матрицей для этой м-РНК. 2. Определите нуклеотидную последовательность и ориентацию концов фрагмента одной из нитей молекулы ДНК, если известна последовательность и ориентация комплементарного участка другой нити этой молекулы: 3’-A-T-C-G-T-T-C-G-A-5’. 3. Какие факторы являются определяющими при выборе клонирующего вектора? 4. В биотехнологическом процессе получения рекомбинантного белка возможна метаболическая перегрузка. Что такое метаболические перегрузки и что является их причиной? 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 4-х циклов ПЦР, если сначала имелось пять копий фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой. Вариант 9. 1. Определить аминокислотный состав полипептида, который кодируется последовательностью и-РНК: ЦЦА ЦЦУ ГГУ УУУ ГГЦ. 2. Определите направление синтеза и нуклеотидную последовательность каждой из двух дочерних нитей, которые возникнут при репликации приведенного ниже двухцепочечного фрагмента ДНК: 3’-A-G-T-C-T-T-G-C-A-5’ 5’-T-C-A-G-A-A-C-G-T-3’ 3. Что такое вектор в генной инженерии? Приведите пример векторной конструкции. Ответ иллюстрируйте схемой. 4. Иногда стратегия синтеза белка включает получение этого белка в составе химерного продукта. В чем преимущества такого подхода? 5. Сколько копий ДНК можно иметь после 6-ти циклов ПЦР, если сначала имелись десять копий фрагмента ДНК? Ответ иллюстрируйте схемой.
|
