Молекулярна маса.

Для характеристики гомогенності білка спочатку визначають його молекулярну масу. Найпоширенішими методами її визначення є ультрацентрифугування, гель-електрофорез, осмометричний, дифузійний і рентгеноструктурний аналізи, методи електронної спектроскопії та ін. За допомогою цих методів було встановлено, що молекулярна маса білків коливається в межах від кількох тисяч до кількох мільйонів (інсулін – 6 тис. од., альбумін молока – 17.4 тис. од., яєчний альбумін – 40 тис. од., гемоглобін людини – 68 тис. од., сироватковий γ-глобулін 160 тис. од., фібриноген – 330 тис. од., актоміозин – 5000 тис. од.)

 

3. Амфотерність.

Білки, як і амінокислоти, - це амфотерні сполуки, тому в кислому середовищі вони дисоціюють як основи, а у лужному – як кислоти.

Завдяки наявності в складі амінокислот тих або інших радикалів, білкові молекули часто мають заряд позитивний або негативний, причому в різних середовищах цей заряд різний. Завдяки цьому білки можна очищати, розділяти методом електрофорезу.

Під час взаємодії з кислотами або основами білки утворюють солеподібні сполуки. На цьому принципі засновано їх осадження з водних розчинів, наприклад, трихлороцтовою кислотою. З амфотерними властивостями білків пов’язана їх буферна дія, тобто підтримання в тканинах і клітинах організму постійної реакції середовища.

Для білків, поліпептидів і амінокислот характерний так званий ізоелектричний стан. Ізоелектричний стан (ІС) – це такий стан білкової молекули, при якому вона має нульовий заряд.

Значення рН, при якому молекула знаходиться в ІС, називається ізоелектричною точкою (ІТ ). Залежно від амінокислотного складу кожний білок має свою ізоелектричну точку. В ізоелектричній точці білок найменш стійкий, легше всього осаджується і руйнується. На цьому заснований метод дрібного осадження білків із розчину після досягнення значення рН, що відповідає ізоелектричній точці одного із компонентів суміші. Інші білки залишаються в розчині.

 

4. Розчинність.

Більшість білків розчиняються у воді й утворюють колоїдні розчини.

Білки, розчиняючись у воді, утворюють колоїдні розчини. Це такі розчини, діаметр частинок яких перевищує 0,001 m.

Білки виявляють гідрофільні властивості, тобто мають спорідненість до води. Розчинності білків, як і інших речовин, сприяють фактори, які зменшують взаємодію між молекулами речовин, що розчинені. На поверхні білкової молекули розташовані різні гідрофільні групи, що притягують до себе дипольні молекули води. Гідрофільність різних функціональних груп різна, наприклад, пептидна група —CO—NH— зв’язує одну молекулу води, карбоксильна группа —COO^– - чотири молекули води, групи —NH₂ і —SH по одній молекулі води. Ті з молекул води, які розташовані ближче до поверхні білкової молекули, орієнтовані до неї певним чином. Чим далі від поверхні білка віддалені диполі води, тим безладніше їх розташування у розчині. Диполі води, що утворюють гідратну оболонку навколо білкової молекули, утримують білок у розчині.

Таким чином, найбільше значення мають фактори, що утримують білок у розчині:

1. Підсумований заряд білка, який визначається співвідношенням катіонних і аніонних груп в радикалах амінокислотних залишків білка;

2. Наявність гідратної оболонки.

Білки утримуються в розчині завдяки наявності гідратній оболонці. Гідратна оболонка орієнтується навколо білкової молекули через наявність на ній якогось заряду.

 

 

Якщо до розчину білка додати водовіднімаючий засіб або додати речовини, що нейтралізують заряд білкової молекули (гідратна оболонка зруйнується), розчинність білка знизиться. При цьому відбувається його осадження. Реакції осадження білка можуть бути оборотними і необоротними. Оборотним називається таке осадження, при якому утворений осад білка може розчинятися в первісному розчиннику. Якщо утворюється осад білка, що згодом не може розчинитися в первісному розчиннику, то осадження необоротне.

З водних розчинів білки осаджуються нейтральними солями високих концентрацій (додавання невеликих концентрацій нейтральних солей збільшує розчинність білків у воді). Це явище одержало назву висолювання. Висолювання здійснюють за допомогою амоній сульфату, натрій (або калій) фосфату, натрій гідрогенсульфату тощо. Висолювання білків найбільш ефективне в ізоелектричній точці, оскільки при цьому єдиним фактором, який стабілізує білок у розчині, є гідратна оболонка. Іони солі притягують молекули води, зменшуючи розчинність білка й підвищуючи його здатність до осадження. Осадження білків відбуваєтьсяя інтенсивніше при низькій температурі. Висолювання білків це зворотний процес. Після видалення солі діалізом білок можна розчинити у воді або початковому розчині. Метод висолювання використовується для одержання індивідуальних білків у кристалічному стані.

Оборотне осадження білка здійснюється також під дією спирту або ацетону. Спирт, як гідрофільний реагент, руйнує гідратну оболонку білкової молекули, внаслідок чого здійснюється осадження білка. Якщо дія спирту нетривала, гідратна оболонка може відновлюватися.

Якщо білок втрачає один з цих факторів, він випадає в осад. Наприклад, якщо відняти у білкових молекул диполі води, що пов’язані з ними, і зменшити таким чином їх гідратацію, то вони почнуть злипатися, утворюючи більш крупні частинки білка і почнуть осідати в розчині у вигляді осаду:

C₂H₅OH

дегідратація

 

 

білкова частина, яка несе сумарний (+) дегідратована частинка

заряд і оточена гідратною оболонкою білка без гідратної оболонки

 

При необоротних реакціях осадження відбувається денатурація білків, так як осади білків втрачають властиві їм нативні (природні), тобто певні фізико-хімічні та біологічні властивості, в силу чого ці осади не переходять у розчин під дією первісного розчинника. Необоротне осадження білка з розчину викликають:

а) солі важких металів (Cu, Pb, Hg, Au та ін.);

б) алкалоїдні реактиви;

в) концентровані мінеральні кислоти;

г) деякі органічні кислоти.

 

а) З солями важких металів білки утворюють міцні солеподібні комплексні сполуки, що випадають в осад, і не розчинюються в первісному розчиннику.

При використанні CuSO₄ і Pb(CH₃COO)₂ як осадників, їх надлишок викликає розчинення утвореного осаду білка, що виникає внаслідок адсорбції надлишку іонів металу та перезарядки білкового комплексу:

 

 

розчин білка + CuSO₄ осад білка

(мала кількість) (необоротне осадження)

 

осад білка + CuSO₄ [ білок › Cu]²⁺SO₄^2-

(надлишок) перезаряджений комплекс

білка з іоном важкого

металу що розчиняється у воді

 

б) Необоротне осадження білка алкалоїдними реактивами зумовлено наявністю в молекулі білка азотистих гетероциклічних угрупувань, що знаходяться в молекулах алкалоїдів. Це пірольні, індольні та імідазольні угрупування.

До алкалоїдних реактивів відносяться танін (міститься в чаї), фосфорно-вольфрамова і фосфорномолібденова кислоти, розчини йодної ртуті в KI, розчин вісмут йодиду в KI, калій гексаціаноферат, пикринова кислота та ін.

Осадження білка при дії алкалоїдних реактивів здійснюється внаслідок утворення нерозчинних солеподібних сполук, в яких білок є катіоном, а алкалоїдний реактив — аніоном.

в) Необоротне осадження білків концентрованими мінеральними кислотами (окрім фосфатної) відбувається внаслідок дегідратації білкових частинок та утворення солей із білка та кислоти. Осади білків при цьому не розчинюються в первісному розчиннику, але можуть бути розчинені в надлишку відповідних мінеральних кислот (окрім нітратної) в результаті утворення перезарядженого комплексу.

г) Деякі органічні кислоти (наприклад, 3%-ова трихлороцтова кислота CCl₃COOH) є специфічними осаджувачами білків та викликають їх необоротне осадження внаслідок дегідратації білкових частинок та утворення солі із білка та кислоти.

Колоїдний стан і великі розміри молекул перешкоджають проникненню білків крізь штучні напівпроникні та клітинні мембрани. Цим користуються для очищення розчину білка від низькомолекулярних домішок і розчинників, які вільно дифундують крізь пори штучної напівпроникної мембрани (пергамент, целофан та ін.). Такий метод очищення називається діалізом. Якщо в целофановий пакет налити білковий розчин, забруднений низькомолекулярними домішками, а потім пакет помістити в склянку з дистильованою водою, то через якийсь час домішки проникнуть крізь пори целофану і перейдуть у воду, а білок залишиться в целофані.

Для колоїдних розчинів білків характерний оптичний ефект Тіндаля, тобто здатність розсіювати промені світла і опалесцилювати.

 

5. Денатурація білків.

Під дією різних факторів нативна (природна) просторова структура високомолекулярних полімерів, побудованих з амінокислот, може порушуватися, при цьому утворюються біла нерозчинна маса, звідки і їх назва – білки. Цей процес називається денатурацією. Якщо дія денатуруючого агента нетривала, то в деяких випадках можливе відновлення білкової структури. Цей процес називається ренатурація.

В денатурованих білках змінюється переважно вторинна, третинна та четвертинна структура, а пептидний зв’язок зберігається. Внаслідок порушень структурної організації змінюється розчинність білків, їх оптична активність, розміри молекул, збільшується в’язкість. Білок стає менш стійким у водному розчині й легше осаджується, підвищується реакційна здатність деяких функціональних угрупувань (SH- ОН- серину, тирозину і імідазольних груп аргініну). Механізм денатурації посягає в розгортанні поліпептидного ланцюга. Денатуровані білки набувають вигляду випадкових хаотичних петель і клубків, форма яких підлягає зміненню. В такому стані білки легше зазнають дії протеолітичних ферментів.

При денатурації порушується або цілком втрачається розчинність, специфічна біологічна активність, змінюються основні властивості білків.

Денатуруючі фактори можуть розділятися на фізичні і хімічні.

Фізичні фактори, що викликають денатурацію: температура, механічний вплив, тиск, ультразвукове й іонізуюче випромінювання.

Теплова денатурація білків – одна з характерних їхніх ознак. Швидкість теплової денатурації залежить від рН середовища, іонної сили розчину. Найбільш повне і швидке осадження відбувається в ІТ. Денатурація відбувається при розтиранні сухих препаратів, збиванні, енергійному струшуванні розчинів.

При ліофілізації (висушуванні у вакуумі шляхом сублімації вологи з замороженого стану) структура більшості білків не змінюється. Тому цей засіб використовується для тривалого зберігання білкових препаратів.

Хімічні фактори, що викликають денатурацію: кислоти, луги, органічні розчинники, поверхнево-активні речовини, алкалоїди (кофеїн, теобромін).

Денатурація білків має величезне значення для всіх живих організмів. При старінні живих організмів відбувається денатурація білків, зменшується їхня гідрофільність. Так, наприклад, при старінні насіння денатурація білків приводить до втрати їх здатності до проростання. Порушення структури, що здійснюється під час денатурації, полегшує доступ ферментів до пептидних зв'язків, які вони розщеплюють. Тому денатуровані білки легше переварюються, ніж нативні. У шлунку людини виробляється хлоридна кислота, що також викликає денатурацію білка, допомогаючи, таким чином, ферментам у розщепленні білка і засвоюванню організмом. Крім цього, денатурація білків відбувається при сушінні макаронів, овочів, молока, яєчного порошку, при виготовленні консервів, випічці хліба, кондитерських виробів.

I.6. Класифікація білків.

 

Головними ознаками, що лежать в основі класифікації білків, є їх склад або фізіко-хімічні властивості та форма молекул.

За складом або фізико-хімічними властивостями білки поділяють на прості (протеїни) та складні (протеїди) Простими називають білки, внаслідок гідролізу яких утворюються лише амінокислоти. Продуктами гідролізу складних білків, поряд з амінокислотами є речовини небілкової природи (вуглеводи, ліпіди, фосфатна кислота, нуклеїнові кислоти та ін.) Небілковий компонент складних білків називається простетичною групою.

Однак, класифікація білків на прості та складні є умовною. Так, прості білки гістони можуть модифікуватися (фосфорилюванням, метилюванням, ацетилюванням та ін.) і перетворюватися на складні білки.

Залежно від форми або конформації білки можна розділити на два основних класи – глобулярні та фібрилярні.

Протеїни. До цих білків належать гістони, протаміни, альбуміни, глобуліни, глютеліни, проламіни, протеїноїди. Вони характеризуються різними фізіко-хімічними властивостями.

Гістони та протаміни є найпростішими сильноосновними білками з молекулярною масою 4000 –12000. Вони характеризуються високим вмістом діаміномонокарбонових кислот, переважно аргініну, лізину та гістидину. Гістони та протаміни містяться в ядрах клітин вищих тварин. Гістони представлені кількома індивідуальними молекулярними фракціями, які різняться вмістом основних амінокислот (21-30%), електрофоретичною рухомістю та локалізацією. Протаміни містять у своєму складі до 80% діаміномонокарбонових кислот, тобто вони є полівалентним органічним катіоном і тому легко взаємодіють з молекулами, що мають надлишок негативно заряджених груп, наприклад з нуклеїновими кислотами

Протаміни вміщуються у великій кількості в статевих клітинах риб, ссавців, людини. Їх називають за джерелом одержання: сальмін (із молок семги), скумбрін (із скумбрії), клупеїн (із оселедця) та ін. Гістони та протаміни відіграють важливу роль у формуванні структури й функціонуванні ядерного нуклеопротеїдного комплексу – хроматину.

Альбуміни та глобуліни досить поширені в клітинах рослинних та тваринних організмів. Альбуміни добре розчиняються у воді та сольових розчинах, висолюються в розчині амоній сульфату у межах насичення 80 – 100%. У альбуміні міститься багато амінокислоти лейцину (до 15%), є також лізин, аспарагінова та глутамінова кислоти, в дуже незначній кількості – гліцин. Альбуміни є в крові, де вони завдяки адсорбційним здібностям виконують транспортну функцію у лімфі, а також у цитоплазмі всіх клітин. У курячих яйцях вміст альбумінів досягає 50%, їх також багато у молоці та молочних продуктах.

Глобуліни – це глобулярні білки, що погано розчиняються в сольових розчинах і зовсім не розчиняються у воді. Вони повністю висолюються розчином сульфату амонію в межах насичення 50%. За хімічною природою глобуліни близькі до альбумінів, однак дещо багатіші на гліцин (до 3%). У організмі глобуліни виконують захисні функції, оскільки є специфічними антитілами (переважно γ-глобуліни), а також беруть участь у процесах згортання крові (фібриноген). Глобуліни вміщуються у великих кількостях у насіннях, особливо бобових і олійних рослин, у крові та інших біологічних рідинах (лімфі).

До глобулінів відносяться: білок крові – фібриноген, білок насіння гороху – легумін, білок насіння квасолі – фазеолін, білок коноплі - едестин.

Глютеліни та проламіни – прості білки рослинного походження. До глютелінів належать білок зерна пшениці – глутенін, зерна кукурудзи – глутелін, рисового зерна – оризенін. Ці білки не розчиняються у воді, але розчиняються в розчинах розведених кислот і лугів.

Особливістю хімічного складу проламінів є високий вміст амінокислоти проліну. До проламінів належать зеїн – білок насіння кукурузи, гордеїн – вівса, гліадин – жита та пшениці. На відміну від глютелінів проламіни добре розчиняються у 70-80%-му спирті. На цій властивості засновані методи їх розділення.

Протеїноїди - фібрилярні білки опорної тканини (кісток, хрящів, волосся, сухожилів). Особливістю цих білків є їх нерозчинність у воді, сольових розчинах, слабких розчинах кислот і лугів. Представниками протеїноїдів є колаген (білок сполучної тканини) і осеїн (органічна основа кісткової тканини, фіброїн (білок шовку). Протеїноїд кератин, що входить до складу волосся, пір’я, копит у великих кількостях містить амінокислоту цистеїн.

Протеїди. Це складні білки, що складаються із простого білка та небілкової частини – простетичної групи. До складних білків належать хромопротеїди, фосфопротеїди, ліпопротеїди, глікопротеїди, нуклеопротеїди.

Хромопротеїди складаються з простого білка та забарвленої простетичної групи, якою є похідні ізоалоксазину (флавінові ферменти), каротину (родопсин) і порфірину (гемоглобін, міоглобін, гемінові ферменти – каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза та ін.). Простетична група деяких хромопротеїдів містить метал. Так, до складу гемоглобіну, міоглобіну, каталази, пероксидази та цитохрому входить Ферум, гемоціаніну – Купрум, хлорофілу – Манган. До хромопротеїдів належать гемопротеїди, флавопротеїди, ретиніліденпротеїди та ін.

Одним з найважливіших гемопротеїдів є гемоглобін. Він складається з білка глобіну та простетичної групи гему. Молекулярна маса гемоглобіну – 60000-70000. Гем є похідним протопорфірину. Основою структури протопорфірину є порфін – тетрапіролова сполука, в якій пірольні кільця з’єднані між собою метиновими групами (=СН-). Гем – це хелатний комплекс протопорфірину з атомом Феруму, який коордінаційно зв’язаний із чотирма атомами Нітрогену пірольних кілець. Молекула гемоглобіну містить чотири поліпептидні ланцюги (два α і два β), кожний з яких зв’язаний із однією групою гему.

Гемоглобін легко взаємодіє з різними газами. Найважливішим похідним гемоглобіну є оксигемоглобін. Це нестійка сполука, що у разі зміни парціального тиску легко дисоціює на гемоглобін і кисень. Гемоглобін утворює стійку сполуку з СО - (карбон (II) оксидом). При цьому утворюється карбоксигемоглобін, ступінь дисоціації якого значно менший, ніж гемоглобіну. Тому внаслідок одночасного вдихання кисню та СО порушується нормальний процес транспорту кисню (гемоглобін міцніше зв’язує СО), що може привести до тяжких наслідків і навіть до смерті. Приєднання кисню або СО до гемоглобіну не змінює валентність Феруму. Однак, під дією деяких окислювачів гемоглобін перетворюється на метгемоглобін, який містить тривалентне залізо. Метгемоглобін не може бути переносником кисню.

Міоглобін складається з однієї молекули білка глобіну та одного гему. Молекулярна маса міоглобіну становить близько 17000. Міоглобін відіграє дуже важливу роль у забезпечені киснем м’язової тканини. Спорідненість міоглобіну з киснем значно вища, ніж гемоглобіну.

До хромопротеїдів належать також цитохроми. Вони є компонентами дихального ланцюга й мають велике значення для здійснення окисно-відновних процесів. Цитохроми складаються з однопептидного білка і гему, зв’язаних між собою залишками пропіонової кислоти. Валентність заліза гему цитохромів змінюється в процесі перенесення електронів. Таку ж функцію в організмі виконують ферменти каталаза та пероксидаза. У молекули каталази чотири геми, її молекулярна маса – 225000. Пероксидази мають один гем; молекулярна маса різних пероксидаз коливається в межах 44000 – 92 000.

У рослинах міститься хромопротеїд, який складається з білка та хлорофілу. Нині відомо два типи хлорофілу – хлорофіл а і хлорофіл в. Основою будови хлорофілу є протопорфірин, який зв’язаний із атомом Магнію двома основними та двома додатковими валентностями. Хлорофіл, який є складним ефіром двохосновної кислоти та двох спиртів – метилового та високомолекулярного ненасиченого спирту – фітолу. Міститься в хлоропластах у комплексі з білком і ліпоїдами. Він відіграє важливу роль у процесах фотосинтезу зелених рослин.

Хромопротеїди, які не містять металів, називаються флавопротеїдами.

Їх простетичною групою є рибофлавін у складі флавінаденіндинуклеотиду (ФАД) або флавінмононуклеотиду (ФМН), ковалентно зв’язаного з апоферментом. Флавопротеїди необхідні для перебігу окисно-відновних процесів.

До групи хромопротеїдів входять також ретиніліденпротеїди, хромофорними угрупуваннями яких є ретиналі. Вони локалізовані в сітківці ока й виконують специфічну функцію - фоторецепцію. Тому їх також називають зоровими пігментами. Вони складаються з білкового (опсин) та небілкового (хромофорна група) компонентів. Як правило, хромофорна група в ретиніліденпротеїдах представлена 11- цис -ретинолем або 11- цис -3,4-дегідроретинолем і зв’язана з опсином ковалентним зв’язком.

Фосфопротеїди – це складні білки, що містять білковий компонент і залишок фосфатної кислоти, яка з’єднана ефірним зв’язком із гідроксильними групами гідроксиамінокислот – серину та треоніну. Найважливішими представниками цієї групи білків є казеїноген молока, вітеленін, вітелін, вітин яєць, іхтулін – білок сперми риб. Фосфопротеїди беруть активну участь у обмінних процесах, особливо в ембріональних та швидкоростучих тканинах. Деякі фосфопротеїди мають ферментативну активність (пепсин, фосфорилаза та ін.).

Ліпопротеїди – це група складних білків, які містять білки та ліпіди (холестерин, фосфатиди, жири та ін.). Ліпопротеїди розчинні у воді та нерозчинні в органічних розчинниках (ефірі, бензені, хлороформі та ін.). Вони є головними компонентами біологічних мембран, у вільному стані містяться в плазмі крові, лімфі, молоці, яєчному жовтку та ін.). У вигляді розчинних ліпопротеїдних комплексів у організмі транспортується багато біологічно активних речовин.

Глікопротеїди – це складні білки, які, крім білка або пептиду, містять в своєму складі групу гетероолігосахаридів. Природні глікопротеїди поділяються на типові (нейтральні) та мукопротеїди (кислі). Мукопротеїди поділяють на хондромукопротеїди та гіаломукопротеїди. Хондромукопротеїди містять хондроїтинсульфатну кислоту та входять до складу хрящів, а гіаломукопротеїди – гіалуронову кислоту й містяться в основній речовині сполучної тканини. Поліпептидні ланцюги білкового компонента глікопротеїдів з’єднані з вуглеводним компонентом переважно через гідроксильні групи гідроксиамінокислоти (серину та треоніну) або через карбоксильну групу аспарагінової кислоти.

Глікопротеїди відіграють важливу функціональну роль. Деякі з них є антикоагулянтами. Глікопротеїд пропердин – природний антибіотик; муцини, стійкі до дії ферментів і виконують захисну функцію, запобігаючи розщепленню слизової оболонки травними ферментами. Деякі ферменти та пептидні гормони мають глікопротеїдну природу.

Нуклеопротеїди. Це – складні білки, що містять прості білки та нуклеїнові кислоти. Білковий компонент нуклеопротеїдів зазвичай складається з гістонів або протамінів. Залежно від природи нуклеїнової кислоти розрізняють два види нуклеопротеїдів. До складу рибонуклеопротеїдів (РНП) входить рибонуклеїнова кислота (РНК), до складу дезоксирибонуклеопротеїдів (ДНП) – дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК). Нуклеопротеїди входять до складу вселяких клітин, приймають участь в утворенні структурних елементів та передачі спадкоємної інформації.

За формою молекули білки поділяються на глобулярні та фібрилярні. Глобулярні білки мають кулясту, еліпсоїдну або овальну форму молекул. До них належать більшість розчинних білків сироватки крові, майже всі відомі нині ферменти, білки молока, деякі гормони, антитіла та ін. Фібрилярні білки складаються з паралельно розташованих поліпептидних ланцюгів і утворюють витягнуту нитковидну молекулу. До цієї групи належать білки волосся – кератин, шовку – фіброїн, м’язів – міозин тощо. Так, фібрилярні α-кератини складаються з поліпептидних ланцюгів (трьох або семи), які мають α-конфігурацію й розташовані паралельно. Основа структури фібрилярного білка колагену – потрійні спіралі, які складаються з трьох поліпептидних ланцюгів. Волокна α-кератину утворюють суперспіралі. Така структура фібрилярних білків дуже важлива для їх функціонування. Фібрилярні білки мають велику міцність, можуть стискатися та розправлятися. Вони нерозчинні у воді та розведених сольових розчинах.