Очистка стоков и выбросов

Мы рассмотрели схему основного биотехнологического производства, которое на некоторых стадиях, если не на всех, имеет определенные стоки и выбросы в атмосферу. Очистка этих стоков и выбросов — специальная задача, которая обязательно должна решаться в наше экологически неблагополучное время. По существу очистка стоков — это отдельное биотехнологическое производство, имеющее свои подготовительные стадии, биотехнологическую стадию, стадию отстаивания биомассы активного ила и стадию дополнительной очистки стоков и переработки осадка. Очищенная вода иногда может быть возвращена в основное производство. Так организована, например, безотходная технология получения кормового белка из парафинов нефти.

 

18. Подготовительные операции при использовании в производстве биообъектов микроуровня.

Подготовительные стадии служат для приготовления и подготовки необходимых видов сырья биотехнологической стадии.

На стадии подготовки могут быть использованы следующие процессы.

Приготовление среды,обычно жидкой, включающей необходимые компоненты питания для биотехнологической стадии.

Стерилизация среды — для асептических биотехнологических процессов, где нежелательно попадание посторонней микрофлоры.

Подготовка и стерилизация газов (обычно воздуха), необходимых для протекания биотехнологического процесса. Чаще всего подготовка воздуха заключается в очистке его от пыли и влаги, обеспечении требуемой температуры и очистке от присутствующих в воздухе микроорганизмов, включая споры.

Подготовка посевного материала. Очевидно, что для проведения микробиологического процесса или процесса культивирования изолированных клеток растений или животных необходимо подготовить и посевной материал — предварительно выращенное малое по сравнению с основной стадией количество биологического агента.

Подготовка биокатализатора. Для процессов биотрансформации или биокатализа необходимо предварительно подготовить биокатализатор — либо фермент в свободном или закрепленном на носителе виде, либо биомассу микроорганизмов, выращенную предварительно до состояния, в котором проявляется ее ферментативная активность.

Предварительная обработка сырья. Если сырье поступает в производство в виде, непригодном для непосредственного использования в биотехнологическом процессе, то проводят операцию по предварительной подготовке сырья. Например, при получении спирта пшеницу сначала дробят, а затем подвергают ферментативному процессу «осахаривания», после чего осахаренное сусло на биотехнологической стадии путем ферментации превращается в спирт.

Другой пример — использование древесины для получения дрожжей. Древесину сначала измельчают, а затем подвергают нагреву до 200°С в кислой среде. В результате такого процесса частичного гидролиза происходит превращение древесины в раствор глюкозы и лигнин. Раствор глюкозы (гидролизат) как раз и используется в биотехнологическом процессе для получения кормовых дрожжей.

 

19. Питательные среды. Классификация. Компоненты питательных сред. Методы стерилизации.

Питательные среды по своему составу подразделяются на две группы: натуральные (естественные) и синтетические.

Натуральными называются среды, имеющие неопреде ленный химический состав, так как в них входят продукты растительного или животного происхождения, отходы различных производств. На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, так как в этих средах имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития.

Синтетическими называются среды, в состав которых входят только определенные химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Такие среды широко используются для исследований, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

По физическому состоянию среды подразделяются на жидкие, плотные и сыпучие.

Жидкие среды используются для накопления биомассы или продуктов метаболизма. Плотные среды готовят из жидких, добавляя агар-агар иди кремнекислый гель (силикагель). Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не может использовать его в качестве субстрата и поэтому он является лишь уплотняющим средством. В холодной воде полисахарид нерастворим, но растворяется в ней при нагревании до высокой температуры (90-100° С). При охлаждении агаровая среда застывает в виде студня с гладкой поверхностью. Такие среды используются для выделения чистых культур, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов и в ряде других случаев.

Сыпучие среды - разваренное пшено, перловая крупа, Отруби, пропитанные питательным раствором - используют в промышленной микробиологии для получения некоторых БАВ, например, ферментов.

В промышленности микробного синтеза широко используются чистые углеводы, а также природные и технические продукты, богатые углеводами. К ним относятся глюкоза, сахароза, лактоза, крахмал, кукурузная мука, меласса, зеленая патока.

Для приготовления питательных сред используются техническая глюкоза. Она содержит не менее 99,5% редуцирующих веществ (в пересчете на сухой остаток) и фактически представляет собой чистый углевод,

Сахароза - свекловичный или тростниковый сахар. Техническая сахароза, используемая в промышленности, содержит не менее 99,75% сахарозы, которая представляет собой дисахарид, состоящий из глюкозы и фруктозы.

Лактоза - молочный сахар. Она содержится только в молоке и в других природных продуктах не обнаружена. Получают лактозу из молочной сыворотки, которая образуется при производстве сыров, творогов, казеина. Лактоза представляет собой дисахарид состоящий из глюкозы и галактозы.

Крахмал - на 96-97% состоит из полисахаридов, кроме того, в нем присутствуют минеральные вещества и жирные кислоты. Полисахариды крахмала представлены двумя типами - амилазой (10-20%) и амилопектином (80-90%).

Крахмал получают из картофеля или кукурузы. Крахмалы разного происхождения значительно различаются по разветвленности цепей, степени полимеризации и некоторым другим свойствам. Под действием амилолитических ферментов крахмал расщепляется до глюкозы, которая в дальнейшем утилизируется продуцентом по гликолитическому или пентозофосфатному путям,

Кукурузную муку получают при разматывании зерен кукурузы. В промышленных средах кукурузная мука часто заменяет крахмал, являясь более дешевым сырьем. Кукурузная мука содержит: крахмал - 67-70%; другие углеводы (клетчатка, пептозаны, растворимые углеводы) - 10%; белки - 12%; зола - 0,9%.

Среди зольных элементов в небольшом количестве присутствуют ионы фосфора, калия, магния. Состав кукурузной муки может колебаться в значительных пределах в зависимости от сорта кукурузы, условий ее выращивания и хранения.

Меласса - отход сахарного производства. Она представляет собой маточный раствор, образующийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифуге после третьей кристаллизации. По внешнему виду меласса - густая вязкая жидкость темно-коричневого цвета. Состав непостоянен и может колебаться в зависимости от почвенных и климатических условий выращивания свеклы, технологии ее переработки, условий транспортировки и хранении мелассы.

Нормальная меласса в среднем содержит: сухие вещества - 75-82%, сахароза - 45-50%, общий азот - 1,2-2,2%, зола 6-10%. В мелассной золе присутствует много калия, магния, кальция, железа, но сравнительно мало фосфора. Кроме того в мелассе содержится ряд аминокислот, витаминов группы В и органических кислот.

Зеленая патока - отход производства глюкозы их крахмала. Она содержит не менее 76% редуцирующих веществ, золы - не более 3,5%, сухих веществ - не менее 50%. Сахара зеленой патоки состоят в основном из глюкозы. Основная часть зольных элементов - хлористый натрий, образующийся при нейтрализации соляной кислоты, применяемой для гидролиза крахмала содой.

Азотное питание микроорганизмов по своему значению приближается к углеродному, хотя уступает последнему по объему. Азот входит в состав клеточных компонентов, которые обеспечивают жизнеспособность организмов. Источниками азотного питания для продуцентов БАВ служат различные азотсодержащие вещества неорганического и органического происхождения. Источниками минерального азота чаще всего являются соли аммония и азотной кислоты. В качестве органических источников азота в промышленности наиболее широко применяются кукурузный экстракт и соевая мука.

Кукурузный экстракт - это отход производства крахмала из кукурузы. По внешнему виду это густая жидкость темно-коричневого цвета с хлопьевидной взвесью или почти однородная. В состав кукурузного экстракта входят: азот общий - 6-8%; азот шинный - 1-3%; азот белковый - 0.8-2%; углеводы - 0-10%; органические кислоты - 15-20%; зола - не более 24%.

Основными элементами золы являются фосфор, калий, магний Кукурузный экстракт также содержит витамины группы В, некоторые ростовые вещества, биостимуляторы.

Соевую муку получают при размалывании соевых бобов, а также соевого жмыха и шрота, образующихся после извлечения соевого масла Соевая мука подразделяется на необезжиренную, полуобезжиренную и обезжиренную. Кроме того, соевая мука бывает дезодорированная (обработанная паром) и недезодорированная. Обработка паром позволяет увеличить срок хранения, и дезодорированная мука может храниться в течение года, а недезодорированная - 1,5 - 3 месяца.

Из основных компонентов соевой муки особое значение для процессов ферментации имеют азотсодержащие вещества. Азот соевой муки находится главным образом в составе белков, на долю которых приходится 40,5%. Кроме белков в соевой муке содержатся углеводы - до 25%; органические кислоты - 1,5%; зола 4,5-6,5%. В необезжиренной муке присутствует 19,5% жира. В состав золы входят ионы калия, фосфора, магния, кальция, а также ряд микроэлементов.

Минеральные компоненты играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизмов. Содержание их в клетке относительно не велико, но функции чрезвычайно важны. Минеральные элементы в клетках микроорганизмов необходимы для регулирования осмотического давления, окислительно-восстановительных условий и величины рН. Они изменяют гидрофильность протоплазмы, а также играют и пластическую роль, входя в состав конструктивного материала клеток.

Минеральные элементы участвуют в формировании пространственной структуры биополимеров - белков и нуклеиновых кислот.

Одна из основных функций минеральных элементов - участие в ферментативном катализе. В настоящее время действие четвертой части всех ферментов в клетки связано с металлами. Минеральных состав питательной среды формирует распределение электрических зарядов на поверхности клетки. Обычно клетки микроорганизмов имеют отрицательный заряд. При добавлении в среду электролитов он снижается и тем сильнее, чем выше валентность добавляемого противоиона. Изменение электрического потенциала клеток может изменить их физиологическую деятельность, воздействовать на селективность клеточной мембраны, вызвать флокуляцию или флотацию клеток.

Конструкция и механизм действия системы стерилизации зависят от метода стерилизации биореактора, вспомогательного оборудования, питательных сред и воздуха.

Наибольшее значение имеют термический метод для стерилизации оборудования и сред и фильтрационный — для удаления микроорганизмов из вводимого в биореактор воздуха или другого газа. Как правило, для стерилизации сред и аппаратуры используют влажную термическую обработку с применением воды и пара. Такая обработка дает больший эффект, чем нагревание сухого биореактора. Чаще всего используют стерилизацию перегретым паром, вводимым под давлением непосредственно в аппарат или генерируемым в самом биореакторе. Однако в последнем случае среда, содержащая белки, пригорает к электронагревателю, размешенному в аппарате, поэтому реактор стерилизуют с нагретой дистиллированной водой, а среду стерилизуют отдельно.

Эффективность и быстрота уничтожения микрофлоры возрастают но мере повышения температуры: имеет место температурная зависимость, аналогичная уравнению Аррениуса для химических реакций. Высокая температура нагревающего агента (пара, витков спирали электронагревателя) обеспечивает быструю гибель термоустойчивых бактериальных спор, которые часто попадают в «островки теплоизоляции» — глыбки твердых субстратов, густые суспензии высокомолекулярных соединений и т. д.

В то же время по мере повышения температуры ощутимо возрастают энергозатраты на стерилизацию, усиливается отрицательное влияние нагревания на качество сред. Следовательно, необходимо найти оптимальную температуру, при которой достигается высокая надежность стерилизации и в то же время сводятся до минимума энергозатраты и порча стерилизуемого материала. Применение пара, подаваемого через змеевики без прямого контакта со средой, ограничивает эффективность стерилизации. Этот метод используется при стерилизации неводных сред, например масляных.

Нагревание вызывает химические превращения компонентов питательных сред. При 100°С и выше карбонильные группы сахаров вступают во взаимодействие с ионами аммония или с аминогруппами аминокислот и белков. При этом образуются неусваиваемые клетками продукты. Этот пример говорит о необходимости в некоторых случаях раздельной стерилизации компонентов питательной среды.

Разложение ряда веществ, например витаминов, вынуждает ограничить время и температуру для термической стерилизации соответствующих сред, а иногда — вовсе отказаться от нее, поэтому применяют химические дезинфицирующие средства или фильтрацию жидкостей. Фильтры, однако, быстро забиваются клетками микрооорганизмов и другими взвешенными частицами, чем обусловлено неудобство фильтрационного метода стерилизации жидких сред.

Иногда химические изменения субстратов в процессе термической стерилизации положительно влияют на качество сред. При стерилизации раствора, содержащего глюкозу, аминокислоты и фосфаты, путем фильтрации или путем раздельной термической обработки растворов перечисленных компонентов получается среда, малоподходящая для роста пропионовых бактерий. Напротив, совместная стерилизация аминокислот, фосфатов и глюкозы путем нагревания способствует росту этих бактерий.

Фильтрация воздуха или другого газа обычно обходится без частой смены фильтров, поскольку в них содержание взвешенных частиц меньше, чем в жидких средах. Из фильтров различных типов наиболее перспективны.мембранные фильтры из тефлона с диаметром пор около 0,2 мкм. Такие фильтры эффективно задерживают частицы с размерами, в 100 раз меньшими указанного диаметра пор. Это связано в основном с броуновским движением частиц в воздухе, отклоняющим их от прямолинейной траектории, что обусловливает высокую вероятность столкновения частиц со стенками пор и их адсорбцию. Вследствие этого фильтрация приводит к освобождению воздуха не только от бактерий и их спор, но и от бактериофагов и других вирусов (R. S. Conway, 1984, Т. Leahy, R. Gabler, 1984). На второй план отступает применение фильтров других видов, сложенных из гранул активированного угля или волокон стеклянной ваты, вискозы, целлюлозы.

 

 

20. Очистка и стерилизация технологического воздуха. Схема подготовки потока воздуха, подаваемого в ферментатор.

Система производства сжатого, очищенного от микроорганизмов, воздуха, имеющего определенную температуру, является сложой технологической системой.

Она состоит из трех последовательно соединенных подсистем:очистки от пыли и сжатия; приведения воздуха к; термодинамическому состоянию, благоприятному по влажности и температуре для разделения аэрозоля; разделение аэрозоля в фильтрах грубой и тонкой очистки.

Первая подсистема. Атмосферный воздух забирают турбокомпрессором через заборную шахту высотой 20-30 м, где концентрация микроорганизмов стабилизирована. Прежде всего воздух попадает в предфильтры, где он освобождается от грубого аэрозоля - пыли. Првдфильтры не только предохраняют комлрессоры от затрязнения. но и существенно снижают количество контаминантов. которые могди бы попасть во 2-ю подсистему.

За рубежом в настоящее время в предфидьтрах применяют рулонные пористые материалы. В нашей стране успешно испыган пенополиуретан, который обеспыливается пьшесосом или теплой водой с мылом. Срок службы материала 1,5-2 года. Однако до сих пор на болыгшнстве заводов исполъзуют масляные фильтры (см. рис). После этого воздух сжимают в турбокомпрессоре до 0,35-0,5 Мпа. Давление сжатия воздуха в компрессоре определяют из расчета давления на преодоление сопротивления в системе воздухоподготовки, давления столба жидкости в ферментаторе и создания в нем давления 0,13-0,14 Мпа. Сжатие воздуха в компрессоре приводит к повышению его температуры до 120-250°С и увеличению влагосодержания в единице объема.

Вторая подсистема. В случае высокого содержания влаги в исходном атмосферном воздухе конденсируется еще большее количество влаги при его охлаждении. Выпадение влаги на фильтрах недопустимо, так как это прнводит к слипанию волокон и образованию каналов, и тогда эффекты, осаждения частиц на волокне не проявляются. Кроме того, на увлажненных волокнах фильтров возможно размножение осевших микроорганизмов, что приводит к дополнительному обсеменению воздуха.

Чтобы обеспечить выпадение влаги в каплеуловителе, воздух «переохлаждают» до температуры 25-40°С в теплообменном аппарате. Затем, для обеспечения надежной работы фильтров 2-й и 3-й ступеней, воздух нагревают до температуры 70-90°С. При таких температурах, исключается конденсация паров воды на волокнах фильтра. С этой нелью воздух после брызгоуловителя подогревают в теплообменнике, при этом допускается частичное подмешивание горячего воздуха после компрессора. Количество подмешиваемого воздуха определяется условиями относительной влажности, которая не должна быть больше 40%.

Третья подсистема состоит из двух фильтров второй и третьей ступеней очистки. Фильтр второй ступени, или головной фильтр обычно расположен на территории завода рядом с цехом. На головном фильтре очищают воздух для всех ферментаторов цеха. Из головного фильтра воздух по кодлектору подается в индивидуальные фильтры третьей ступени, установленные у каждого ферментатора, независимо от его вместимости.

Конструкция индивидуатьного фильтра зависит от типа используемого фильтрующего материала. Для ткани Петрянова применяют конструкцию, представленную на рис. В цилиндрический корпус монтируют прямоугольный пакет, собранный из П-образных алюмшшевых рамок, между которыми зажимается лента из ткани Петрянова.

Для фильтрующего материала, сложенного в виде матов, используют конструкцию, представденную на рис. Изображена конструкция, предназначенная для установки фторопластовых фильтрующих элементов.

При эксплуатации фильтров необходима ихстерилизация.

Наиболее эффективным методом является нагревание влажным паром и выдержка в течение определенного времени при температуре 125-130°С, Применение более высокой температуры вызывает деструкцию герметизирующих прокладок в фильтрах. После стерилизации фильтрующий материал высушивают горячим воздухом.

В зарубежных системах очистки воздуха значительно повышена надежность работы за счет установки дополнительной ступени очистки и дублирования основного оборудования. Кроме того, для крупных ферментаторов применяют автономные системы очистки воздуха, что облегчает задачу поддерживания термодинамического режима, так как не требуется большой протяженности трубопроводов; наконец, в фильтрах используют стандартные фильтрующие элементы, изготовленные промышленным способом.

Очистка отработанного воздуха. В процессе ферментации в качестве отхода производства образуется большое количество отработанного воздуха, выбрасываемого в атмосферу. Установлено, что такой воздух на заводах антибиотиков содержит от 2 до 4 мг/м³ вещеетв с неприятным запахом.

С отработанным воздухом выбрасывается в атмосферу несколько десятков органических соединений: амины, альдегиды, жирные кислоты, кетоны, спирты, эфиры и т.д. Относительная влажность воздуха, выходяшего из ферментатора, приближается к 100%; кроме того он включает культуральную жидкость в виде мелких брызг; а со-держание клеток продуцента зависит от вида его, времени ферментации, и составляет от 1 х 10⁵ до 1 х 10⁵ клеток в 1 м³.

В настоящее время применяют несколько принципиально различающихся методов очистки отработанного воздуха. Метод каталитического дожигания относится к разряду энергоемких. Суть его состоит в том, что отработанный воздух прокачивают при температуре 320-350⁰С через комбинированный катализатор, состоящий из слоя пиролюзита и слоя палладиевого катадизатора, Степень обезвреживания воздуха 87-98,5%.

Менее энергоемким является метод жидкофазного окисления с применением в качестве окислителей перманганата калия или гипохлорита натрия. Отработанный воздух по мере прохождения скруббера орошается раствором натрия гипохлорита,20% раствором едкого натра, водой и выбрасывается в атмосферу. Орошающие растворы обращаются в замкнутом цикле. Смену отработанных растворов проводят в 1 раз в неделю. Эффективность очистки 90-95%. Недостатком метода является то, что при его реализации накапливаются в небольшом количестве сточные воды, которые нужно утилизировать. Такие установки успешно работают, например, в Италии в производстве пенициллина, цефатоспорина С и других антибиотиков.

Известен также метод с применением сетчатых фильтров (ФС); конструкция ФС разработана по ВНИИ проектно-конструкторском институте прикладной биохимии. Фильтр состоит из цилиндрического корпуса с крьппкой и днищем, внутри помещен фильтрующий элемент, изготовленный из металлических сеток трикотажного плетения с диаметром проволоки 0,28 мм из нержавеющей стали(рис.).

Воздух, проходя через фильтр, освобождаегся от капелек культуральной жидкости с микроорганизмами. Эффективность очистки 99.6%. Для повышения эффективности очистки на ряде заводов осуществлена схема, состоящая из циклона и сетчатого фильтра «Ц-ФС». Эффективность зтой системы составляет 99,97%.

 

21.Критерии подбора ферментаторов. Характеристика и классификация биореакторов в зависимости от вида протекающих в них процессов и от конструкционных особенностей (способы потребления энергии, способы смешивания и ввода энергии и др.).

Промышленное производство биопрепаратов представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических, биофизических, биохимических, физикохимических процессов и предполагает использование большого количества разнотипного оборудования, которое связано между собой материальными, энергетическими потоками, образующими технологические линии.

Основным аппаратурным элементом биотехнологического процесса является биореактор ферментер (рис.). Биореакторы предназначены для культивирования микроорганизмов, накопления биомассы, синтеза целевого продукта. Биореакторы изготавливают из высоколигированных марок стали, иногда из титана. Внутренняя поверхность биореактора должна быть отполирована.

Типовые ферментеры представляют собой вертикальные ёмкости различной вместимости (малые от 1 до 10 л, многотоннажные более 1000 л) с минимальным числом штуцеров и передающих устройств. В биореакторах должны быть обеспечены оптимальные гидродинамические и массообменные условия.

Ферментеры снабжены паровой рубашкой, мешалками, барботерами, стерилизующими воздушными филырами, отбойниками, обеспечивающими необходимые температурный, газовый режим, гидродинамическую обстановку в биореакторе (т.е. процессы массо и теплообмена). В биореакторах имеются пробоотборники для отбора проб культуральной жидкости в процессе биосинтеза. Могут быть и другие конструктивные особенности, учитывающие специфику биотехнологического процесса. Работа отдельных узлов контролируется измерительными приборами, фиксирующими как параметры технологического процесса, так и отдельные физикохимические показатели культивирования (температуру стерилизации и культивирования, скорость вращения мешалки, давление, расход воздуха или газов на аэрацию, пенообразование, рН, еН, р02, рС02 среды).

Тип биореактора, чистота обработки внутренних стенок аппарата и отдельных его узлов, ёмкость, коэффициент заполнения, поверхность теплоотдачи, способ отвода тепла, тип перемешивающих, аэрирующих устройств, арматура и запорные приспособления, способ пеногашения, далеко не полный перечень отдельных элементов, которые, в отдельности и во взаимосвязи, влияют напроцесс культивирования микроорганизмов и клеток.

Биореакторы подразделяют на три основные группы:

- реакторы с механическим перемешиванием;

- барботажные колонны, через которые для перемешивания содержимого пропускают воздух;

- эрлифтные реакторы с внутренней или внешней циркуляцией; перемешивание и циркуляция культуральной среды в них обеспечивается потоком воздуха, за счет которого между верхним и нижним слоями культуральной среды возникает градиент плотности.

Биореакторы первого типа используют чаще всего, так катс они позволяют легко изменять технологические условия и эффективно доставлять к растущим клеткам воздух, определяющий характер развития микроорганизмов и их биосинтетическую активность. В таких реакторах воздух подают в культуральную среду под давлением через разбрызгиватель кольцо с множеством маленьких отверстий. При этом образуются мелкие пузырьки воздуха и за счет механического перемешивания обеспечивается их равномерное распределение. Для этой же цели используют мешалки одну или несколько. Мешалки, разбивая крупные пузырьки воздуха, разносят их по всему реактору и увеличивают время пребывания в культуральной среде. Эффективность распределения воздуха зависит от типа мешалки, числа оборотов, физикохимических свойств среды.

При интенсивном перемешивании культуральной среды происходит ее вспенивание, поэтому рабочий объем биореактора не превышает 70% от общего объема. Свободное пространство над поверхностью раствора используется как буферное, где накапливается пена, и таким образом предотвращается потеря культуральной жидкости. В пенящейся жидкости условия аэрации лучше, чем в плотных растворах (при условии непрерывного перемешивания и циркуляции слоя пены, т.е. при исключении нахождения микроорганизмов вне культуральной жидкости). Вместе с тем вспенивание может привести к переувлажнению фильтров в отверстиях, через которые воздух выходит из биореактора, уменьшению потока воздуха и к попаданию в ферментер посторонних микроорганизмов.

Консгпруктивные особенности барботажных колонн и эрлифтных биореакторов дают этим типам ферментеров некоторые преимущества перед реакторами с механическим перемешиванием. Барботажные колонны более экономичны, так как перемешивание в них происходит восходящими потоками воздуха равномерно по всему объему. Отсутствие механической мешалки исключает один из путей проникновения в биореактор посторонних микроорганизмов. В барботажных биореакторах не возникает сильных гидродинамических возмущений (сдвигов слоев жидкости культуральной среды относительно друг друга).

Уменьшение сдвиговых факторов важно по следующим причинам: клетки рекомбинантных микроорганизмов менее прочны, чем нетрансформированные; клетка отвечает на внешние воздействие уменьшением количества синтезируемых белков, в том числе рекомбинантных; под влиянием сдвиговых эффектов могут изменяться физические и химические свойства клеток, что затрудняет дальнейшую работу с ними (ухудшаются условия выделения, очистка рекомбинантных белков). В барботажных колоннах воздух подают под высоким давлением в нижнюю часть биореактора; по мере подъема мелкие пузьфьки воздуха объединяются, что влечет неравномерное его распределение. Кроме того, подача воздуха под высоким давлением приводит к сильному пенообразованию.

В эрлифтных биореакторах воздух подают в нижнюю часть вертикального канала. Поднимаясь, воздух увлекает за собой жидкость к верхней части канала, где расположен газожидкостный сепаратор (здесь частично выходит воздух). Более плотная деаэрированная жидкость опускается по другому вертикальному каналу ко дну реактора и процесс повторяется. Таким образом, в эрлифтном биореакторе культуральная среда вместе с клетками непрерывно циркулирует в биореакторе.

Эрлифтные биореакторы выпускаются в двух конструктивных вариантах. В первом реактор представляет емкость с центральной трубой, которая обеспечивает циркуляцию жидкости (реакторы с внутренней циркуляцией). У эрлифтного биореактора второго типа культуральная среда проходит через отдельные независимые каналы (реактор с внешней системой циркуляции).

Эрлифтные биореакторы более эффективны, чем барботажные колонны, особенно в суспензиях микроорганизмов с большей плотностью или вязкостью. Перемешивание в эрлифтных ферментерах более интенсивно и вероятность слипания пузырьков минимальна.

 

22.Аппаратурное оснащение биотехнологических процессов. Особенности проведения процессов нестерильных и стерильных производств. Аэробные и анаэробные процессы.

По основной фазе,в которой протекает процесс ферментации, различаются:

1) поверхностная (твердофазная) ферментация (культивирование на агаровых средах, на зерне, производство сыра и колбас, биокомпостирование и др.);

2) глубинная (жидкофазная) ферментация, где биомасса микроорганизмов суспендирована в жидкой питательной среде, через которую при необходимости продувается воздух или другие газы;

3) газофазная ферментация, в которой процесс протекает на твердом носителе, где закрепляются микроорганизмы, но сами частицы носителя взвешены в потоке газа, насыщенном аэрозолем питательной среды. Надо сказать, что подобный способ ферментации используется довольно редко, в основном при очистке газов от вредных и одорирующих примесей,

По отношению к кислороду различают аэробную, анаэробную и факультативно-анаэробную ферментацию — по аналогии с классификацией самих микроорганизмов.

Анаэробные процессы. Реакторы для анаэробных процессов не имеют приспособлений для аэрирования среды. Однако некоторые из этих процессов протекают с потреблением газообразных субстратов — водорода, метана, поэтому приходится применять барботер и другие приспособления для подачи газа в жидкость. Например, установка для бактериальной денитрификации воды (ее очистки от нитратов и нитритов), функционирующая в анаэробных условиях, включает приспособление для обеспечения водородом. Перемешивание среды в ходе анаэробных процессов осуществляется низкоскоростной механической мешалкой или созданием тока жидкости по циркуляционному контуру. В зависимости от того, насколько строго следует придерживаться анаэробных условий, применяют конструкционные детали, предохраняющие среду культивирования от контакта с кислородом.

Упрощение конструкции аппаратов при ведении процессов в анаэробных условиях, естественно, ведет к их удешевлению — фактор, побуждающий отказываться от аэробных процессов в пользу анаэробных, в частности, при очистке сточных вод. В то время как аэробное расщепление органических субстратов ведет к их полному «сжиганию» до СО₂ и Н₂О, в анаэробных условиях микроорганизмы образуют ценные низкомолекулярные продукты — спирты, ацетон, органические кислоты. Внимание биотехнологов к анаэробным процессам повышается в связи с дефицитом нефти и природного газа.

Поверхностное культивирование биообъектов в жидкой питательной среде вблизи раздела фаз газ — жидкость — распространенный метод, хотя и уступающий по эффективности синтеза целевого продукта глубинному методу культивирования. Однако метод остается в ходу применительно к процессам, сопровождающимся накоплением внеклеточных продуктов в культуральной среде или зависящих от контакта между организмом и воздушной средой. Такой контакт требуется для мицелиальных грибов при переходе к определенным стадиям развития. Экономический выигрыш связан с относительной простотой изготовления и эксплуатации биореакторов.

 

 

23.Характеристика биопроцессов в зависимости от целевых продуктов: первичные и вторичные метаболиты, биомасса как целевой продукт.

Чаще всего целевой продукт находится либо в самой биомассе, либо в жидкости. В обоих случаях необходимо сначала разделить эти две фазы. В зависимости от свойств биомассы и жидкости для них целей могут быть использованы различные процессы.

Отстаивание — разделение под действием гравитационных сил (обычно при очистке сточных вод).

Фильтрация — пропускание суспензии через фильтрующий материал, на котором задерживаются частицы твердой фазы — биомасса. Такой способ применяют в производстве антибиотиков, особенно в тех случаях, когда микроорганизм-продуцент имеет мицелиальный характер.

Сепарация, центрифугирование — разделение под действием центробежных сил. Наиболее часто используется для отделения дрожжей или бактерий в производстве кормовой биомассы.

Микрофильтрация, ультрафильтрация - через мембраны с весьма малым размером пор, удержание клеток микроорганизмов на мембране и получение створа, свободного от взвешенных клеток. Ультрафильтрация задерживает уже не только клетки, но и крупные молекулы.

Коагуляция - добавление в суспензию реагентов, способствующих образованию и осаждению более крупных клеточных агломератов и отделению их от жидкости путем отстаивания.

Флотация - захват биомассы микроорганизмов пузырьками пены и выделение ее из пенной фракции.

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ БИОСИНТЕЗА. Эта стадия имеет определенные отличия, связанные с тем, являются продукты внеклеточными или внутриклеточными.

Так, для внутриклеточных продуктов сначала необходимо разрушить клеточную оболочку одним из методов, среди которых можно назвать следующие.

Дезинтеграция клеток. Этот процесс разрушения клеточной оболочки может осуществляться физическими методами (с помощью мелющих тел, путем замораживания и продавливания, воздействием ультразвуком, методом декомпрессии — резкого сброса давления, или химическими и биотехнологическими методами.

Пиролиз — разрушение клеточных оболочек пол действием химических реагентов и температуры.

Ферментолиз — разрушение клеточных оболочек под действием ферментов при повышенной температуре.

Автолиз — разновидность ферментолиза, когда используют собственные ферменты клетки.

После проведения предварительной операции разрушения клеток, выделение целевого продукта осуществляется из раствора методам и, которые являются общими для внеклеточных и внутриклеточных продуктов.

Экстракция — переход целевого продукта из водной фазы в несмешивающуюся с водой органическую жидкость (экстрагент). Наиболее известно выделение жироподобных веществ жидкими углеводородами (типа бензина), но применяются и многие другие виды экстрагентов (хлороформ, эфир, бутилацетат). Экстракция прямо из твердой фазы (в том числе и биомассы микроорганизмов) называется экстрагированием.

Осаждение — выделение целевого продукта путем добавления к жидкости реагента, взаимодействующего с растворенным продуктом и переводящего его в твердую фазу.

Адсорбция — перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его сорбции па специальных твердых носителях (сорбентах).

Ионный обмен - то же, что адсорбция, но в этом случае в твердую фазу переходят ионы (катионы или анионы), а не целиком молекула целевого продукта или примеси.

Отгонка, ректификация — эти методы используют для выделения растворенных в культуральной жидкости легкокипящих продуктов. Пример — этиловый спирт.

Ультрафильтрация, нанофильтрация и обратный осмос применяются для выделения высокомолекулярных соединений (белков, полипептидов, полинуклеотидов). Обратный осмос и нанофильтрация позволяют отделять даже небольшие по размеру молекулы.

Центрифугирование, ультрацентрифугирование используют для выделения вирусов, клеточных органелл, высокомолекулярных соединений.

 

24.3начение асептики в биотехнологических процессах. Методы стерилизации, используемые в биотехнологическом производстве.

Асептика (от греч. А - не, нет, septos - гниение) - это комплекс мероприятий, направленных на предотвращение попадания в среду (объект) посторонних микроорганизмов, включая болезнетворные. Следовательно, асептика в биологической технологии и. например, в хирургии - это не одно и то же понятие. В первом случае предполагают использование какого-либо биообъекта (в том числе - микроба) и полное исключение попадания других микроорганизмов, являющихся загрязнителями. Во втором случае стремятся исключить любую возможность попадания патогенных микробов и микробов-контаминантов на операционное поле или в рану.

Каждый из материальных потоков в биотехнологических процессах - потенциальный источник микробов - контаминантов.

Асептика может включать влажную уборку помещений, обработку их ультрафиолетовыми лучами, антисептическими средствами, использование стерильных инструментов, сред, технологической одежды, подачу стерильного воздуха (столы с ламинарным потоком стерильного воздуха в боксированных помещениях, поступление в ферментатор стерильного воздуха через барботер - от франц. barbotage - перемешивание) и пр. Следовательно, комплекс мер, обеспечивающих асептику биотехнологических процессов, включает: механическую, физическую, химическую защиту биообъекта и среды его обитания, а при необходимости - и конечный продукт. К механической защите относятся: удаление механических примесей, например, из воздуха, культиваторов, герметизация оборудования, изоляция узлов и соединений; к физической - обработка воздуха и поверхностей приборов и аппаратов ультрафиолетовыми лучами, кипячение, стерилизация паром под давлением, обработка ультразвуком; к химической - обработка поверхностей химическими антисептиками.

В производственных условиях источниками микробов-контаминантов могут быть почва, вода, окружающий воздух, люди. Из почвы в сферу биотехнологических процессов попадают спорообразующие палочки-бациллы, конидии грибов, актиномицеты; эти же микроорганизмы с пылью могут попасть в воздух, через посредство которого они способны проникнуть в среду выращивания биообъекта или в конечный продукт производства.

Качественный состав и размеры частиц в воздушной пыли колеблются в широких пределах, В производственных помещениях это зависит от конструкционных особенностей здания, розы ветров, географической зоны расположения города и предприятия, наличия или отсутствия потоков автомобильного и другого транспорта, количества непосредственно занятых в технологическом процессе людей, характера и локализации складских помещений и т.д.

Образующиеся пыль и капельки влаги в воздухе, как правило, содержат на своей поверхности слой адсорбированного воздуха и большее или меньшее количество микроорганизмов. Газовая оболочка предохраняет частицы от смачивания. Такие частицы представляют собой дисперсную фазу аэрозоля. устойчивость которой зависит от размеров (величины) частиц, их электрического заряда и поверхностной энергии. Необходимо помнить, что в случае нахождения на частицах аэрозоля микробных клеток их отрицательный электрический заряд будет приносить свою долю в общий заряд частицы. Опираясь лишь на величину аэрозоля, содержащего микроорганизмы, можно выделить три фазы его: крупноядерную (диаметр частиц более 100 мкм), мелкоядерную (диаметр частиц менее 100 мкм) и фазу бактериальной пыли (диаметр частиц от 1 мкм до 100 мкм). Частицы крупноядерной фазы в течение нескольких секунд оседают из воздуха, тогда как частицы двух других фаз могут длительно находиться в воздухе, образуя устойчивую коллоидную систему.

Бактериальная пыль может формироваться из первых двух фаз после их высыхания и повторного попадания в воздух. В разряд частиц с диаметром от 0,001 мкм до 1 мкм подпадают вирусы и некоторые бактерии. Аэрозоли могут быть вредными и для человека не только из-за микробов, находящихся на частицах пыли или капельках жидкости, но и сами по себе вследствие проникновения в альвеолы дыхательной системы с последующим расстройством ее функций. В таком понимании вредными являются следующие аэрозольные частицы: асбеста, алебастра, абразивного порошка, графита, гипса, диоксида титана, дорожной пыли, извести, каолина, корунда, карбида кремния, мрамора, оксида олова, стекловолокна. В альвеолы проникают частицы размером менее 3 мкм при скорости потока вдыхаемого воздуха уже около 1 см/с.

По степени загрязненности воздуха микробами и механическими частицами в расчете на 1м³ производственные помещения, в которых асептично изготавливают лекарственные средства, классифицируют по классам следующим образом:

1-й класс чистоты с ламинарным потоком стерильного воздуха - для изготовления стерильных лекарств - не должно быть микробов, а механических частиц размером до 0.5 мкм - не более 3500;

2-й класс чистоты - до 50 микробных клеток, до 2500 частиц размером 5 мкм и до 350000 частиц размером 0.5 мкм;

3-й класс чистоты - до 100 микробных клеток (ЗА класс - до 200 и ЗБ класс - до 500 клеток), до 25000 частиц размером 5 мкм и до 3500000 частиц размером 0,5 мкм;

4-й класс чистоты - по ГОСТ 12.1.005 - 86.

Для помещений 2-го и 3-го классов чистоты, в которых изготавливают нестерильные лекарственные средства, нормирование воздуха по содержанию механических частиц не предусматривается.

Лекарственные средства по «микробной чистоте» разделяют на 4 категории:

1) стерильные препараты для инъекций, приготовленные на апирогенной воде;

2) глазные лекарства, препараты для введения в закрытые полости тела, средства для лечения обширных ожогов и открытых ран не должны содержать живых микроорганизмов - они также относятся к разряду стерильных;

3) лекарственные средства для наружного применения и для введения в открытые полости не должны содержать более 100 живых микробныхклеток в 1 г (мл) препарата и при безусловном отсутствии в них бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, а также Pseudomonas aeruginosae и Staphylococcus aureus;

4) все прочие лекарственные средства должны содержать в 1 г (1мл) не более 1000 жизнеспособных бактериальных клеток сапрофитов и не более 100 клеток непатогенных грибов при отсутствии болезнетворных и условно патогенных микроорганизмов, включая энтеробактерии, Pseudomonas aeruginosae и Staphylococcus aureus, аспорогенные дрожжи рода Candida.

Работающие в помещениях различной степени чистоты должны одевать рекомендуемую и пригодную для таких целей технологическую одежду (согласно требованиям системы GMP). Так, в помещениях первого класса, где кратность обмена воздуха в час 600-200, надевают стерильный костюм, головной убор должен полностью закрывать волосы, включая бороду, и заворачиваться под ворот костюма, на лицо одевается маска во избежание попадания частиц и капель в окружающую среду; на руки одевают стерилизованные без сыпучих материалов перчатки из каучука или пластичных материалов, на ступни - стерилизованную или продезинфицированную обувь, включая бахилы. Низ брюк подворачивают в обувь (как и рукава костюма - в перчатки). От защитной одежды не должны попадать в воздух частицы и волокна, а сама она должна задерживать частицы, исходящие с тела оператора. Указанная одежда должна быть разового использования или использоваться в течение одного дня, если результаты проверки подтверждают такую возможность. Перчатки рекомендуется постоянно дезинфицировать во время операций, маски и перчатки необходимо менять перед каждой рабочей процедурой. Стерильную зону желательно проектировать таким образом, чтобы все операции можно было наблюдать извне. В рабочих зонах таких помещений все открытые поверхности должны быть гладкими, непроницаемыми, неразбитыми, удобными для очистки и дезинфекции, где и когда это необходимо, без труднодоступных выступов и углублений, полок, шкафов, излишнего оборудования, раздвижные двери здесь нежелательны из-за возможности скопления пыли в пазах; сточные и канализационные трубы не должны проходить в стерильных зонах. Комнаты для смены одежды необходимо спроектировать встроить с воздушными шлюзами, снабжающимися стерильным воздухом. Двери с воздушными шлюзами не должны открываться одновременно; между шлюзами должна быть система для визуального или аудиоконтроля (от лат. visis - зрение, audio - слух, слышание). Мытье рук и средства для этого должны быть только в комнате для смены одежды.

В рабочие помещения должен подаваться стерильный воздух под положительным давлением.

В помещениях второго класса чистоты с кратностью обмена воздуха 20-60 следует одевать гладкий (без складок), не отделяющий ворса, комбинезон, стянутый на поясе, с манжетами, плотно облегающими щиколотки ног, на голову необходимо надевать шлем-капюшон, полностью закрывающий волосы, нос и подбородок; на лицо - маску, не отделяющую ворса; на руки - резиновые (или из эластичных полимеров) перчатки: на ноги - стерильную или продезинфицированную обувь, поверх которой рекомендуется надевать бахилы, полностью закрывающие ступню. Нижняя часть брюк должна заправляться в бахилы, а рукава комбинезона - в перчатки. Ни одна часть тела или разрешенного для использования нижнего белья не должна быть открыта.

В помещениях третьего класса чистоты с кратностью обмена воздуха 1-15 рекомендуется одевать не отделяющий ворса комбинезон или куртку с собранными рукавами на запястьях и воротником-стойкой, шапочку или косынку, брюки, бахилы и маску.

В помещениях четвертого класса чистоты рекомендуется надевать комбинезон, или куртку и брюки, или халат, шапочку или косынку из хлопчатобумажных или льняных тканей.

Вот почему важно глубокопродумывать размещение помещений в производственных зданиях (особенно - для стерильных лекарств).

С водой в сферу технологического процесса могут попасть грамотрипателыше бактерии из групп Enterobacter, Pseudomonas и некоторых других. В природных открытых водоемах обнаруживаются целлюлозоразрушающие, нитрифицирующие и денитрифицирующие бактерии, цианобактерии, аммонификаторы, железобактерии и многие другие. Лишь вода артезианских колодцев, глубоких скважин и родников отличается высокой чистотой. Следует помнить, что чем больше вода загрязнена органическими веществами, тем больше в ней содержится микробов.

По степени загрязненности открытых водоемов различают 3 зоны сапробности (от лат. sapros - гниль, гниение): полисапробная - сильно загрязненная, содержащая в 1 мл несколько миллионов микробных клеток, включая гнилостные и кишечные бактерии: мезосапробная - умеренно загрязненная, содержащая в 1 мл до 100000 микробных клеток с преобладанием аэробных видов; сапробная- зона чистой воды, содержащей в 1 мл не более 1000 -микробных клеток из представителей железо-, серобактерий и некоторых других видав, Полисапробные зоны характерны для рек, протекающих по населенным пунктам или вблизи них, и где в воду попадают жидкие отходы из крупных свиноводческих ферм, канализационные стоки и стоки промышленных предприятий. В такой воде могут быть санитарно-показательные (Е. coli, Streptococcus faecalis), условно патогенные Pseudomonas, Proteus и другие виды, а также болезнетворные микроорганизмы из группы энтеробактерий.

 

25.Аппаратурное оснащение процессов выделения и очистки продуктов микробного синтеза.

На стадии выделения продукта главная задача — отделить основную часть продукта, пусть даже и с некоторыми примесями. Получается как бы неочищенный продукт. Поэтому, когда необходимо получать биопродукты высокой кондиции, добавляют еще стадию очистки продукта. Задача этой стадии — убрать примеси и сделать продукт максимально чистым.

Эта задача решается с помощью разнообразных процессов, в которых многие из тех, что уже были рассмотрены ранее (экстракция и экстрагирование, адсорбция, ионный обмен, ультрафильтрация и обратный осмос, ректификация и ферментолнз). Кроме этих процессов используют и следующие.

Хроматография — процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков. При адсорбции они и абсорбируются вместе. А вот при хроматографии они выходят из сорбента как бы по очереди, что и позволяет их разделять и, значит, очищать друг от друга.

Диализ — процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей.

Кристаллизация. Этот процесс базируется на различной растворимости веществ при разных температурах. Медленное охлаждение позволяет формировать кристаллы из растворов целевых продуктов, причем чистота их обычно очень высока. Вся «грязь» остаётся в маточном растворе. Таким образом, например, получают кристаллы пенициллина.

Можно даже получить еще более чистый продукт, если кристаллы растворить в воде или растворителе, а потом снова кристаллизовать (т. е. провести процесс перекристаллизации).

 

26. Основные технологические схемы выделения целевого продукта в зависимости от его локализации. Примеры.

26.Схемы выделения целевого продукта в биотехнологическом производстве существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса (общая схема выделения на рис 1). Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскретируется) продуцентом в культуральную жидкость.

Предварительная обработка

сепарация

дезинтеграция

экстракция

экстракция, хроматограция, центрифугирование

хроматограция, центрифугирование,

электрофорез

Рисунок 1. Общая схема выделения БАС на заключительной стадии биотехнологического производства.

Одним из первых этапов на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы - сепарация. Иногда сепарации предшествует специальная обработка культуры - изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков. Существуют различные методы сепарации (флотация, центрафугирование, фильтрование), которые будут подробно рассмотрены в соответствующих разделах.

В данном разделе остановимся на методах гомогенизации (дезинтеграции) клеток или других образцов животного и растительного происхождения.

 

27. Основные принципы культивирования микроорганизмов. Характеристика.

Принципы культивирования микроорганнзмов. С момента внесения микробов (засева) в питательную среду имеет место индукция их физиологической активности, особенно — в логарифмическую и/или стационарную фазы размножения. При этом одновременно сопряженно протекают многие реакции, катализи-руемые иммобилизованными или свободными ферментами. В реакции, особенно — на первых зтапах, нередко вовлекаются высокомолокулярные вещества с определенной конфигурацией молекул (сравнить такие источники утлерода как глюкоза и крахмал или источники азота—аммония сульфат, какая-либо аминокислота и нативный белок). Поэтому следует учитывать специфику выращивания микроорганизмов.

Главные особеиности культивирования микробов в целях получения большинства первичиых и вторичных метаболитов следующие;

1) необходимость применения специальных биореакторов вместимостью 63, 200, 1000 и более м³, в которых возможно поддержание асептических условий в течение сравнительно длительного времени;

2) видовые различия биообъектов, с которыми связаны специфические характеристики питательных сред, кардииальные точки (минимальные, оптимальные и максимальные) температуры и рН;

3) невозможность одновременного поддержания постоянства критериев химического, теплового, диффузионного и гидродинамического подобия, с чем связаны трудности масштабирования биотехнологических процессов;

4) различия в массообмеиных процессах у аэробов и анаэробов — культивирование аэробов осуществляют в трехфазных системах ["твердое тело (клетки)-жидкость-газ"], анаэробы выращивают в виде двухфазных систем ["твердое тело (клетки)-жидкость"];

5)необходимость неремешивания культуральньгх жидкостей в целях улучшения массообмена (кислорода воздуха для аэробов — прежде всего), а это, в свою очередь, индуцирует пенообразование и, как следствие, диктуетнеобходимость прибегать к пеногашению;

6) микроорганизмы чувствительны к воздействию механических, физических и химических факторов;

7) при микробном синтезе целевых лродуктов имеют место индукция, активация, ингибирование, репрессви и некоторые дру-гие регуляториые процессы, усложняющие в целом регуляцию размножения продуцсита и биосинтез им конечного продукта;

8) скорость биосинтеза целевых продуктов более медлеиная по сравнению со скоростями химического синтеза;

9) отдельные виды микроорганизмов, используемых в биотех-нологических процессах, являются болезиетворными и работа с ними должна проводиться с особой тщательностью (дифтерийные и столбнячные палочки, микобактерии туберкулеза, холерный вибрион и др.);

10) некоторыс представители микробного мира должны культивироваться только на (в) живых тканях/клетках (куриные эмбрионы, клетки человека и животных и т. д.); к таким представителям можно отнести вирусы, риккетсии.

Любой биотехнологический процесс реализуют условно в два этапа. Первый из них — предферментация, когда необходимо выполнить все подготовительные работы для реализации второго зтала — ферментации, то есть накопить и выделить целевой продукт.

Предферментация

Это этап включает подготовку питательных сред, биообъекта, воздуха для аэробов и биореактора. Компоненты питательных сред подбирают на основании расчета материального баланса, связанного с трансформацией того или иного источника питания в клеточную биомассу и/или метаболит при учете расхо-дуемой (выделяемой) энергии. Обычно качественный и количественный составы питательных сред указаны в регламентной документации.

Питательные среды, испольэуемые на подготовительном этапе, могут несколько отличаться от среды, применяемой на втором этапе. Так, например, при пересеве лиофильно высушенной ма-точной культуры обычно рекомендуют обогащенные питательными ингредиентами жидкие среды. Последующие пересевы осуще-ствляют вначале на агаризованную ферментационную среду, а затем — на жидкую.

На всех этапах подготовки биообъекта питательные среды перед их засевом должны быть сгерильными. Биообъект, или промышленный штамм в идеале должен удовлетворять основным требованиям:

1) стабильность структурно–морфологических признаков и физиологической активности при длительных хранении и эксплуатацйи в производстве;

2) повышенные скорости роста и биосинтеза целевого(-ых)продукта(-ов) в лабораторных и проигтодственных условиях;

3) достаточно широкий диапазон устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (колебания температуры, рН, аэрация, перемешивание, вязхость срсды);

4) умереиная требовательность к ограниченному числу источников питания; чем более широкий набор источников углерода, азота и других элементов может использовать проиэводственный штамм, тем легче его культивировать и с большей экономической выгодой.

В действительности каждыЙ штамм имеет свои особенности и не по всем показателям отвечает вышелеречисленным требованиям. Как правило, чем богаче усвояемыми ингредиентэми питательная среда, тем лучше растет и метаболизирует на(в) ней микроорганизм. Уже многие годы используют кукурузный экстракт в качестве добавки к питательным средам, поскольку он богат не только источниками углерода и азота, но также микроэлемеитами и витаминами. Сухие вешества в нем составляют 45—55%, в их состав входят зольные вещества —. 1,5—4,5%.

Не менее часто применяют дрожжевой экстракт из клеток Saccharomyces cerevisiae, богатый различными веществами —аминокислотами (аргинином — 5%, валином — 5,5%, гистидином — 4%, изолейцином — 5,5%, лейцином — 7,9%, лизшюм — 8,2%, метионином — 2,5%, тирозином — 5%, треонином — 4,8%, трипто-фаном — 1,2%, фенилаланином — 4,5%, цистином — 1,5%) и витаминами (биотином — 0,06%, инозитом — 0,3%, кальция пантотенатом — 0,01%, кислотой р-аминобензойной — 0,016%, кислотой никотиновой — 0,059%, кислотой фолиевой — 0,001%, пиридоксина монохлоридом — 0,002%, рибофлавином — 0,01%, тиамина монохлоридом - 0,017%, холянхлоридом — 0,27%) в расчете на сухое вещество. К тому же в биомассе клеток дрожжей содер-жится до 50% белков.

Вместо экстракта можно лобавлять автолизат или гидролизат дрожжей.

Объемное и дозирующее оборудование для измерения, транспортировки и загрузки биореакторов аналогично оборудованию, применяемому, например, в пищевой (или вхимической) промыш-ленности: различных типов весы, насосы (например, вакуумные), транспортеры (ленточные, шнековые), элеваторы, контейнеры и др. Газообразные и жидкие продукты обычно подают в биореакторы по системам стерильных трубопроводов. В крупномасштаб-ном производстве питательиыс среды и некоторые их компоненты стерилизуют нагреванием и/или фильтрованием чсрсз пористые мембраны. Тепловая стерилизация может быть периодической и непрерывной; в биотехнологии применяют оба вида стерилизации.

В случае получения лекарствениых средств, например, антибиотиков для парентерального введения, необходима исключительно высокая степень стерильиости питательных сред и целевых про-луктов. При этом необходимо стремиться снизнть, например, вероятность выживания бактериальиых спор до всличииы менее 10^–12, исходя из уравнения:

Понятно, что перед засевом биообъекта стерильными должны быть и питательная среда и биореакторы. Стерилизацию биореакторов часто проводят одновременно со стерилизацией питательной среды в них.

Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым к регламентам инструкциям. В заводской или цеховой лаборатории должна быть подготовлена культура для последующей наработки инокулюма (инокулята), или поссвного материала. В этих целях исходный штамм микроорганизма, сохраняемый в условиях, близ-ких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной суш-ки) оживляют прсле добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду. Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чисток, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить род-ственные связи), операции по пересеву штамма на среду возраста-ющих объемов (площади) повторяют нссколько раз и проводят в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам, помещаемым на качалочные устройства (шотгель-аппараты).

Последующую подготовку биооб-ьекта осуществляют в цсхе, используя неболыиие ферментаторы-инокуляторы, в которых наращивают посевной материал ддя промышленных ферментаций. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины — окончания Log-фазы, то есть когда клетки делятся синхронно. Известно понятие степень синхронизации, то есть степень участия клеток популяции в синхронном делении (О.Шербаум, 1959—1960), выражающаяся в индексе синхронизации (Is):

При необходимости синхронизацию деления можно индуцировать, например, метаболическим шоком (предварительный посев культуры на голодные среды), температурным шоком (смена температур, в частности, пониженных в начале на оптимальные в последующем), или используя одинаковые ио размеру клеткн, механически разделенные, например, фильтрованием (селективные методы) и т. п.

В зависимости от плотности суспензии ее необходимое количество может достигать 1—20% объема производственного ферментатора. Для аэробных микроорганизмов в инокулятор доставляют очищенный стерильный воздух.

Ферментация

Второй зтап биотехнологического процесса, называемый ферментацией. проводят в производственных биореакторах. По биохимической сущности он во многом имитирует предферментацию и поэтому названный термин является условным. Тем не менее, он принят на практике и в специальной литературе и не нуждается в каких-либо дополнительных пояснениях.

В процессе ферментации также необходимо использование стерильных питательных сред, воздуха и биореакторов, выбор которых обусловлен особенностями культивируемых микроорганизмов.

Микроорганизм в виде суспензии определенной плотности подают из инокулятора(-ов) в промышленный биореактор, или ферментатор, в котором содержится стерильная жидкая питательная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом — все соединения системы должны бьпъ герметично закрытыми.

Общий объем ферментатора заполняют инокулированной средой на 70—80%, 20—30% объема заполняют газами (инертным — для анаэробов, воздухом — для аэробов).

Аэрация жидкости способствует пенообразованию, снижающему качестяо ферментации, поэтому используют пеногашение либо механическое (установка в верхнеи части ферментатора специальной дополнительной мешалки), либо физико-химическое (использование ПАВ для снижения поверхностного натяжения на границе раздела фаз "газ-жидкость'').

Длительность ферментаций колеблетея в пределах от 4—5 до 14 суток и дольше, что зависит от особенностей физиологической активности биообъектов. Применительво к биосинтезу антибиотиков и экзогликанов периодические ферментации проводят обычно в течение 4—5 суток.

 

28. Брожение как разновидность биологического окисления. Спиртовое брожение

Броженне — это одна из разновидностей биологического окисления субстрата у гетеротрофных микробов в целях получения энергии, когда акцептором электронов или атомов водорода является органическое вещество. Биотехнологические бродильные процессы изучеиы давно в сравнении, например, с биотехнологией антибиотиков, аминокислот и друтих продуктов. Однако некоторые брожения реализованы на практике относительно недавно, например, брожения с участием Zymomonas spp.

В основе многих бродилъных процессов лежит универсалъная реакция превращения глюкозы (источник углерода) в ключевой промежуточный продукт (интермедиат) — пировиноградную кислоту, или пируват, из которого синтезируются различные конечные продукты. По метаболиту, образующемуся в наибольшем количестве, называют соответствующее брожение: сннртовос, масляно-кислое, молочнокислое, и т. д.

Спиртовое брожение лежит в основе получения этилового спирта, кормовых и пищевых дрожжей, пивоварения и виноделия. Возбудителями спиртового брожения могут быть дрожжи — сахаромицеты, некоторые мицелиальные грибы (Aspergillus oryzae) и бактерии (Erwinia amylovora, Sarcina ventricula, Zymomonas mobilis, Z. anaerobia). Среди названных организмов дрожжи занимают ведущее место, а получение с их помощью этанола относят к разряду наикрупнейших в мире. Эганол используют в различных отраслях народного хозяйства: то как растворитель, то как сырье для химического синтсза, широко используют в медицине, и т. Д.

Специальные штаммы Saccharomycos cerevisiae рекомендованы как биообъекты в производстве этанола (на африканском континенте чаще применяют Schizosaccharomyces pombe и S. octospoms). Штаммы подразделяют в свою очередь на расы верхового и низового брожений, а по способности к флокуляции — на хлопьевидные и пылевидные. Расами верхового брожения являются спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные дрожжи, расами низового брожения — большинство винных и пивных дрожжей. Клетки обеих рас могут быть подвержены флокуляции. При этом следует помнить, что пылевидные дрожжи находятся в диспергированном состоянии в течение бродильного процесса. Они менее стойки к автолизу, но более полно сбраживают сусло; хлопьевидные — оседают на дно или всплывают на поверхность, они более выраженные ароматизаторы.

В отличие от S. cerevisiae аэротолерантные бактерии Z. mobilis меньше чувствительны к этанолу, у них отсутствует катаболитная репрессия, а удельная скорость потребления глюкозы и образования этанола в 2—3 раза выше (qC₂H₅OH= 1,87 г/г»ч). Катаболизм глюкозы протекает по Энтнеру-Дудорову. Однако скорость размнож