Клонирование гибридомных клетокКлонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела, и они могут перерастать антителообразующие гипоидные клетки. К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с помощью прибора — проточного цитофлуориметра.
46. Вакцины на основе рекомбинантных протективных антигенов и живых гибридных носителей. Технологические схемы производства вакцин и сывороток. Субъединичные вакцины состоят из фрагментов антигена, способных обеспечить адекватный иммунный ответ. Эти вакцины могут быть представлены как частицами микробов, так и получены в лабораторных условиях с использованием генно-инженерной технологии. Примерами субъедиинчных вакцин, в которых используются фрагменты микроорганизмов, являются вакцины против Streptococcus pneumoniae и вакцина против менингококка типа А. Рекомбинантные субъединичные вакцины (например, против гепатита B) получают путем введения части генетического материала вируса гепатита B в клетки пекарских дрожжей. В результате экспрессии вирусного гена происходит наработка антигенного материала, который затем очищается и связывается с адъювантом. В результате получается эффективная и безопасная вакцина. Вектор, или носитель, - это ослабленные вирусы или бактерии, внутрь которых может быть вставлен генетический материал от другого микроорганизма, являющегося причинно-значимым для развития заболевания, к которому необходимо создание протективного иммунитета. Вирус коровьей оспы используется для создания рекомбинантных векторных вакцин, в частности, против ВИЧ-инфекции. Подобные исследования проводятся с ослабленными бактериями, в частности, сальмонеллами, как носителями частиц вируса гепатита B. В настоящее время широкого применения векторные вакцины не нашли.
54.Области применения моноклональных антител. Характеристика. Можно использовать моноклональные антитела и в качестве меток для точной идентификации специализированных клеток, например нейронов. Существует также технология использования моноклональных антител для изучения клеточных мембран, позволяющая выделять мембранные белки в чистом виде и измерять их биологическую активность. Кроме того, можно создавать высокоспецифичные вакцины, особенно против определенных вирусных штаммов и паразитов. Моноклональные антитела способны также к нейтрализации лимфоцитов, ответственных за отторжение трансплантата и аутоантител, образующихся при аутоиммунных заболеваниях (некоторые формы диабета, рассеянный склероз, ревматические болезни). В сочетании с лекарственными средствами они могут значительно усиливать эффективность действия последних на клеткимишени, позволяя избегать серьезных побочных явлений, весьма обычных, например при химиотерапии рака. Самыми важными областями использования иммунохимического анализа являются: •контроль банков крови и продуктов из донорской крови; •обнаружение возбудителей в объектах внешней среды; •диагностика инфекционных заболеваний; •диагностика диабета. Сегодня количество проводимых иммунохимических анализов в мире растет настолько стремительно, что производство иммунодиагностикумов совместно с приборами и вспомогательными материалами можно рассматривать уже как отдельную, самостоятельную область биотехнологической промышленности.
47. Культуры растительных клеток. Методы культивирования. Лекарственные препараты, получаемые из каллусных и суспензионных культур. В случае выращивания клеток растений в глубинных (погруженных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые отвечали бы следующим требованиям: склонность к размножению в дезагрегированном состоянии, морфологическая "выравненность", удовлетворительная скорость размножения, сохранность путей метаболизма. Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным микроорганизмам и могут называться "суспензионными культурами" в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и реологические характеристики сред являются основными факторами, определяющими нахождение одиночных или агломерирующихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если число клеток в агломератах превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размножения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда поддержание суспензионной культуры в течение необходимого времени оказывается вполне достижимым. Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплотненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые характеристики (фазы размножения) в-некотором приближении также оказываются совпадающими (lag-фаза, log-фаза, const-фаза, let-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растянуты для клеток растений. Скорость размножения растительных клеток невелика—время удвоения их числа равно 1—3 суткам и поэтому по данному показателю они существенно уступают, например, бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных условиях укладывается для большинства видов в 20—30 минут. Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатноё (непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой продуктивности по биомассе или по вторичным метаболитам (пример с Nicotiana tabacum). Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона-зой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодическом, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензионных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных питательных сред или использованием гомологичной ткани — "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного роста (рис. 143). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкультивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры. Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма. Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые илитяарлевые сита для освобождения от крупных аггломератов клеток. К сожалению, выращивание растительных клеток в "погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена веществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами. В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocheniical Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращиванию воробейника (Lithospermum erythrorbizon) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина, являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красителем. За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг конечного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой (М-9), стимулирующей продукцию шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин). Стоимость красителя в 1983 г. составляла 4000 долларов за килограмм.
48. Культуры животных клеток. Методы культивирования. Любые клетки животного организма происходят из оплодотворенной яйцеклетки, которая со временем развивается и дифференцируется. Зародышевый диск включает эктодерму, эндодерму и мезодерму, из которых впоследствии образуются все ткани макроорганизма. Но как только какую-либо ткань перевести в культуру, то наступает дедифференциация клеток и различить их становится делом трудным или невозможным, и поэтому регистрацию их ведут почти исключительно по происхождению. Например, для исследования в области онкологии важны культуры раковых клеток, о которых имеются сообщения в научной литературе. Такие клетки получены от больных раком легкого и щитовидной железы. В 1986 г. в Японии впервые получен в культуре штамм клеток рака желчного пузыря. Он был стабилен после 103 пассажей in vitro, сохранил прежнее число хромосом в пределах 76—101. Индуцируемый им опухолевый процесс и первичный рак желчного пузыря оказались тождественными по гистограмме. Подобный штамм оказался полезным при оценке противоопухолевых средств. Любой штамм, представляющий определенную ценность для научно-практического использования, должен иметь следующие характеристики: 1) качество исходной ткани - нормальная или опухолевая (для опухолевой необходим показатель доброкачественности или злокачественности), 2)тип ткани — эмбриональная или зрелая, 3)принадлежность ткани — вид животного, 4)источник ткани — орган, 5)тип клетки (если известно), 6)наименование штамма (буквенное — не более 4 букв и серия цифр нумерации), 7)номер клона, если штамм клонировался, 8)источник информации (ссылка на оригинальную публикацию). Все способы выращивания клеток животных могут быть соотнесены либо к интактным (нетрансформированным с помощью вирусов), либо к вирусотрансформированным клеткам. Успех культивирования первых во многом обусловлен наличием и плотностью адгезинов, благодаря которым они проявляют эффект "заякорива-ния" на подлежащей поверхности стекла, металла или пластика. Однако такие клетки не растут в суспензионных культурах. Вирусотрансформированные клетки животных, напротив, хорошо растут в виде суспензионных культур и хуже или совсем не растут в адгезированном состоянии. Имеются такие штаммы животных клеток, которые могут расти и в прикрепленном состоянии, и в виде суспензии. Прикрепившиеся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в форме нескольких слившихся слоев. Подобного результата можно добиться при использовании других факторов воздействия на клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и т. д.). Тем не менее, на практике широко пользуются монослойными культурами. Глубинное выращивание клеток в монослое. Рост клеток в виде монослоя зависит от адгезивных белков — фибронектинов (от лат. fibra — нить, nectere — связывать или соединять), обеспечивающих межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке и направляющих их перемещения. В животном организме клетки, способные к перемещениям (особенно в период эмбрионального развития, при заживлении ран), и связанные с базальными мембранами, содержат на своей поверхности крупномолекулярные гликопротеиновые молекулы фибронектина, открытого в 1973 г. Р.О.Хайнсом (Англия), К. Гамбергом и С.-И. Хакомори (США) при изучении нормальных и опухолевых клеток. Фибро-нектин, полимеризуясь, образует длинные нити вокруг клетки, которые контактируют с клеточной мембраной и связываются с цитоскелетным белком-актином. Молекула фибронектина состоит из двух субъединиц с ММ около 250 кДа, содержащих небольшие по размеру домены и соединенных на одном конце двумя S—S-мостиками. Размеры одной субъединицы 60—70x2—3 нм; на эту длину приходится от 2145 до 2445 остатков аминокислот. Каждый домен отвечает за одну функцию фибронектина, например, за соединение с фибрином, другой домен — за прикрепление к пластику и т. д. Доказано, что фибронектин имеется у всех представителей царства Ammalia. Амфотерный гликопротеин-фибронектин в изолированном виде выраженно стимулирует адгезию, если добавлять его к питательной среде в концентрации порядка 1—5 мкг/мл. Амфолит в данном случае выступает мостиком между отрицательно заряженной поверхностью животной клетки и субстратом, несущим отрицательный или положительный заряд. Свободная энергия поверхности твердого носителя может быть высокой (чистые поверхности стекол, металлов, металлических окислов) или низкой (поверхности из органических полимеров), хотя понятно, что при соответствующих обработках низкоэнергетические поверхности трансформируются в высокоэнергетические. В качестве связующих мостиков можно применять ионы кальция или магния. Наряду с плотностью заряда в прикрепляемости клеток большое значение имеют характеристики субстрата: гидрофильность его поверхности (смачиваемость), протяженность и горизонтальность. Распластываемость клеток на подложке будет выше, если число отрицательных зарядов оказывается не ниже 5 на площади 10 нм2. Адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей в сравнении с гидрофобными, по протяженности они должны быть больше нормальной длины клеток; субстраты с искривленной поверхностью хуже гладких — растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстрата (здесь существен вклад цитоскелета, см.). Если, например, прикрепление клеток к агар-агару принять за единицу, то к тефлону они прикрепляются в 5 раз лучше, к полиэтилену — в 8 раз, к полипропилену — в 9 раз, к резине — в 12 раз, к алюминию — в 15 раз, к стеклу — в 16 раз, а к стали и полистирену — в 20 раз. Крупномасштабное культивирование животных клеток в монослое нацелено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы. Выбранные клетки выращивают в строго, асептичных условиях в специальном оборудовании при медленном вращении роллерной системы или покачивании для смывания большей площади культуральной среды. Клетки то погружаются в жидкую фазу, то в газообразную. При этом с избытком обеспечиваются их дыхательные потребности в кислороде. Во время цикла культивирования клеток должны учитываться разные параметры. Одни из них относятся к числу константных, другие — к числу вариабельных. Константными являются качество материала, форма и объем культиватора, вариабельными — скорость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер (величина) посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание СО2 в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал и концентрация основных источников питания. Первые три вариабельных показателя можно поддерживать постоянными, переводя их в разряд константных. Естественно ожидать, что среды для клеток животных должны отличаться от сред, используемых, например, для прокариот. На начальных этапах развития зообиотехнологии обязательным было добавление сывороток к средам, применяемым в лабораторных и производственных условиях. Сыворотки обеспечивали клетки необходимыми гормонами (глюкокортикоиды, инсулин, половые гормоны, простагландины и др.), ростовыми факторами (эпйдермаль-ным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленек-ротическим и др.), факторами адгезии (коллаген, фибронектин, ламинин), белками (альбумин, трансферрин, фетуин), микроэлементами и липидами, для выживания in vitro. Обычно используют фетальную бычью сыворотку (ФБС). Высоким качеством отличаются сыворотки, рекомендуемые фирмой Sigma (США). Некоторые из них по качеству (для отдельных линий клеток) превосходят ФБС, например, сыворотка крови новорожденных телят в возрасте до 10 дней и менее, сыворотка от телят возраста менее 10-месячного, лошадиная сыворотка от жеребцов, кастрированных за год до взятия крови. Оптимальные показатели рН и температуры зависят от происхождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопитающих концентрацию водородных ионов поддерживают в пределах рН от 7,2 до 7,4, а температуру — в пределах + 36—+ 37,5°С. Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем [(СО2—NaHCO3), трис- и др.], а температуру — с помощью терморегуляторов. Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка). Глубинное выращивание клеток в суспензионных культурах. Площадь выращиваемых клеток можно существенно увеличить при использовании микроносителей, суспендируемых в •питательной среде и на поверхности которых клетки закрепляются, а затем разрастаются в виде монослоя. Такие суспендированные микроносители-с клетками моделируют глубинные культуры, например, микроорганизмов. Следовательно, в таких системах совмещаются монослойные и суспензионные культуры животных клеток. Подход к выбору сред и контролируемого параметра культивирования остается прежним. Клетки после выращивания отделяют от микроносителей центрифугированием (в том числе — в градиенте плотности), фильтрованием, или, чаще, обработкой трипсином с последующими промыванием и сепарированием. Суспензионные клетки на микроносителях применяют в целях получения вирусных вакцин (против бешенства, полиомиелита, ящура). Клеткам животных в глубинных культурах почти во всех случаях требуется защитная матрица, функцию которой берут на себя белки сыворотки крови, добавляемой в среду культивирования. Этим еще раз подтверждается более высокая ранимость животных клеток по сравнению с микробными и растительными клетками. Тем не менее, основные подходы к выбору оборудования и к реализации биотехнологических процессов с использованием животных клеток во многом аналогичны с таковыми в микробной биотехнологии. Например, системы культивирования в обоих случаях могут быть хемо- или турбидостатными, циклическими, непрерывными или полунепрерывными.
49..Антибиотики как биотехнологические продукты. Биологическая роль антибиотиков как вторичных метаболитов. Пути создания высокоактивных продуктов антибиотиков. В мире ежегодно производится антибиотиков почти на 20 млрд долларов. К числу антибиотиков относятся важнейшие противомикробные и противоопухолевые препараты. Открытие антибиотиков произвело переворот в лечении инфекционных заболеваний. Ушли в прошлое представления о неизлечимости многих бактериальных инфекций (туберкулез, сепсис, сифилис и др.). Антибиотики применяют в ряде отраслей народного хозяйства (растениеводство, животноводство, ветеринария, пищевая промышленность и др.), где они используются более широко, чем в медицине. Организация крупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлении промышленной биотехнологии. К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Антибиотики, продуцируемые растительными объектами, называют фитонцидами. Вопрос о физиологических функциях антибиотиков, их месте в метаболизме и процессах эволюции окончательно не решен. Антибиотики возникли в борьбе за существование почвенных биоценозов, поэтому многие из них служат средствами нападения и защиты, т. е. представляют собой своеобразное химическое «оружие» клетки. Однако эти функции у антибиотиков не единственны. Известно, что они могут участвовать в процессах детоксикации вредных метаболитов, контролировать некоторые стороны обмена веществ и целые процессы развития, например дифференцировку клеток, служить запасными питательными веществами. Некоторые исследователи рассматривают антибиотики как случайные вещества, обладающие полезными свойствами, другие считают их реликтовыми молекулами, вытесненными в ходе эволюции продуктами рибосомального синтеза, но и до сих пор сохранившими способность вмешиваться в биохимические процессы. Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флеммингом. Однако лечебные свойства этой плесени были описаны еще в 1871 г. русским дерматологом А. Г. Полотебновым. Количество открываемых антибиотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препаратов. 97% известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. В химическом отношении они представляют сборную группу органических веществ.
50.Биомедицинские технологии. Определение. Характеристика. Биомедицинские технологии – это технологические процессы с использованием биотехнологических систем – живых организмов и компонентов живой клетки. Системы могут быть разными – от микробов и бактерий до ферментов и генов. Биомедицинская технология – это производство, основанное на достижениях современной науки: генетической инженерии, физико-химии ферментов, молекулярной диагностики и молекулярной биологии, селекционной генетики, микробиологии, биохимии, химии антибиотиков. В сфере производства лекарственных средств она вытесняет традиционные технологии, открывает принципиально новые возможности. Биотехнологическим способом способом производят генно-инженерные белки (интерфероны, интерлейкины, инсулин, вакцины против гепатита и т.п.), ферменты, диагностические средства (тест-системы на наркотики, лекарственные вещества, гормоны), витамины, антибиотики, биодеградируемые пластмассы, биосовместимые материалы. В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в медицине – разработка медицинских биопрепаратов, моноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие иммунобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. До появления технологии рекомбинантных ДНК многие лекарственные препараты на основе белков человека удавалось получать только в небольших количествах, их производство обходилось очень дорого, а механизм биологического дейстрия иногда был недостаточно изучен. Предполагалось, что с помощью новой технологии можно будет получать весь спектр таких препаратов в количествах, достаточных как для их эффективного тестирования, так и для применения в клинике. И эти ожидания оправдались. На сегодняшний день клонировано более 400 генов (в основном в виде кДНК) различных белков человека, которые в принципе могут стать лекарственными препаратами. Большинство этих генов уже экспрессированы в клетках-хозяевах, и сейчас их продукты проходят проверку на возможность применения для лечения различных заболеваний человека. Впрочем, хотя более 30 таких биотехнологических препаратов и получило одобрение в США, пройдет еще несколько лет, прежде чем они будут рекомендованы для широкого использования и поступят в продажу; вначале их подвергнут проверке на животных и проведут тщательные клинические испытания. Однако фармацевтические фирмы уже сейчас проявляют к ним интерес. По подсчетам специалистов, ежегодный объем мирового рынка лекарственных препаратов на основе белков человека составляет около 150 млрд. долларов и постоянно растет. Объем мирового рынка лекарственных средств на основе рекомбинантных белков увеличивается на 12—14% в год и к 2007 г. составит примерно 20 млрд. долларов. Разработка новых методов профилактики и лечения многих заболеваний человека внесла огромный вклад в рост благосостояния людей в XX в. Однако этот процесс никогда нельзя считать завершенным. Так называемые «старые» заболевания (например, туберкулез) могут дать о себе знать вновь, как только будут ослаблены профилактические меры или появятся резистентные штаммы. Весьма привлекательной выглядит перспектива применения в качестве терапевтических средств специфических антител; их можно будет использовать для нейтрализации токсинов, борьбы с бактериями, вирусами, для лечения раковых заболеваний. Антитело можно уподобить самонаводящейся ракете, которая либо нейтрализует «нарушителя» — чужеродный агент, либо, если она оснащена «боеголовкой», разрушает специфическую клетку-мишень. К сожалению, несмотря на многообещающие возможности, антитела довольно редко применялись для профилактики и лечения болезней и других патологий. И лишь в последнее время, с развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой методов получения моноклональных антител и с расшифровкой молекулярной структуры и функции иммуноглобулинов, интерес к применению специфических антител для лечения различных заболеваний вновь пробудился.
51.Препараты биогенных стимуляторов. Характеристика. Классификация. Технологические схемы производств. Биогенные стимуляторы, будучи введены в «большой» организм (путем пересадок консервированных тканей или инъекций экстрактов), активизируют в нем жизненные процессы. Усиливая обмен веществ, они повышают физиологические функции организма, в случае болезни – повышают его сопротивляемость и регенеративные свойства, способствуют выздоровлению. Химическая природа биогенных стимуляторов до настоящего времени до конца не изучена. Установлено, что при биостимуляции происходит глубокие биохимические изменения. Процессы образования и накопления биогенных стимуляторов в тканях в результате понижения температуры тщательно изучены А. В. Благовещенским. Автор считает, что при этом нарушаются окислительные и гидролитические процессы, происходит накопление сложной смеси аминокислот и продуктов их дезаминирования. Благодаря окислительному дезаминированию в процессе консервирования тканей из аспарагиновой кислоты образуются яблочная, фумаровая и янтарная кислоты; из фенилаланина — коричная; из тирозина — параоксикумаровая и ряд других кислот. Указанные вещества в случае восстановления нормальных условий для жизнедеятельности клеток или при выделении в другой организм могут соединяться с инертными белками и способствовать их активации. Возможно, что дикарбоновые кислоты, входящие в состав биогенных стимуляторов, соединяясь своими карбоксильными группами со свободными аминными группами белковой молекулы, вызывают в последней деформацию в силовых полях, связанную с образованием новых энергетических уровней. Тем самым повышается способность ферментов к трансформации энергии. Повышение качества ферментов, считает А. В. Благовещенский, как бы омолаживает весь организм. Накопление органических кислот (ацидоз тканей) яблочной, янтарной может образовываться вследствие дезаминирования аспарагиновой кислоты. Превращение яблочной кислоты, благодаря ее дегидрированию и восстановлению фумаровой кислоты, приводит к накоплению янтарной кислоты. Непредельные кислоты ароматического ряда — коричная и оксикоричная — могут образовываться из тирозина и фенилаланина в результате гидролиза гликозидов, содержащих эти кислоты. В консервированных на холоду листьях алоэ А. Ф. Сысоевым также обнаружены разнообразные органические кислоты: лимонная, яблочная, янтарная, рибонуклеиновая, аргинин. Эти кислоты и их натриевые и калиевые соли в определенных концентрациях оказывают стимулирующее действие на рост дрожжевых клеток, повышают дегидразную активность гранулирующих тканей и регенерирующей печени. Количество лимонной кислоты в очитках некоторых растений увеличивается более чем в два раза в процессе биостимуляции. Биологическая активность натриевой и калиевой солей лимонной яблочной и янтарной кислот определенных концентраций оказывают стимулирующее действие на рост дрожжевых клеток, повышают дигидразную активность гранулирующих тканей регенерирующей печени. Имеющиеся к настоящему времени сведения о химическом свойстве препаратов (по В. П. Филатову) показывают, что различные по своему происхождению вещества могут являться общими компонентами для всех препаратов этой группы — органические кислоты, полисахариды; вместе с тем есть и сугубо индивидуальные вещества. Так, летучие амины обнаруживаются в торфе и пелоидодистилляте в отличие от препаратов алоэ, а стероидные гормоны находятся лишь в препаратах плаценты. Обобщение результатов целого ряда работ, посвященных выяснению химического состава, дает возможность сделать некоторые выводы. Биогенные стимуляторы не являются одним каким-либо специфическим веществом, образующимся при биостимулировании тканей. По мнению ряда исследователей, одна из основных ролей в биологической активности консервированных тканей принадлежит органическим карбоновым кислотам, представленным в виде смеси кислот в их естественном соотношении. Соотношения органических кислот могут быть различными, в зависимости от специфики обмена веществ в той или иной ткани. В период стимулирования тканей, помимо карбоновых кислот, накапливаются продукты промежуточного обмена; весьма вероятно, что их присутствие может усиливать биологическую активность карбоновых кислот и таким образом дополнять комплекс активных веществ. Считается, что лечебный эффект тканевой терапии можно отнести за счет специфического действия присутствующих в тканевых препаратах рибонуклеиновой, травматиновой аминокислот, а также азотсодержащих веществ, углеводов, липидов. Тканевые препараты, повышая неспецифическую резистентность организма, в отличие от других препаратов подобного действия, не обладают кумулятивными и анафилактическими свойствами, не вызывают привыкания и усиливают антитоксическую функцию печени. Практическая безвредность тканевых препаратов подтверждается также отсутствием тератогенных, эмбриотоксических и канцерогенных проявлений. Ассортимент препаратов биогенных стимуляторов разнообразен, их получают из тканей как растительного, так и животного происхождения. Препараты биогенных стимуляторов растительного происхождения. Экстракт алоэ жидкий (Extractum Aloe fluidum) – получают из биостимулированных листьев алоэ древовидного (Aloe arborescens). Представляет собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета. Применяется внутрь при язвенных болезнях желудка и двенадцатиперстной кишки, бронхитах и других заболеваниях. Линимент алоэ (Linimentum Aloes). Состав: сока алоэ древовидного (консервированного из биостимулированных листьев) — 78 частей; масла касторового — 10,1 части; эмульгатора — 10,1 части; масла эвкалиптового — 0,1 часть; кислоты сорбиновой — 0,2 части; натрий-карбоксиметилцеллюлозы — 1,5 части. Однородная густая масса белого или светло-кремового цвета с характерным запахом. Применяют наружно при ожогах, для лечения пораженной кожи при лучевой терапии. Выпускают по 30—50 г во флаконах оранжевого стекла. Хранят в защищенном от света месте при температуре до +10 °С. Сок алоэ (Succus Aloes). Готовят из свежесобранных листьев (или деток). Состав: сока алоэ — 80 мл; спирта этилового 95% — 20 мл; хлоробутанолгидрата — 0,5%. Слегка мутная жидкость светло-оранжевого цвета, горькая на вкус. Под влиянием света и воздуха темнеет. Применяют наружно в виде примочек или орошений при лечении гнойных ран, ожогов, воспалительных заболеваний кожи. Внутрь назначают при гастритах, энтероколитах, запорах. Выпускают во флаконах по 100 мл. Хранят в прохладном, защищенном от света месте. Биосед (Biosedum). Водный экстракт из биостимулированной (по В. П. Филатову) свежей травы очитка большого (Sedum maximum (L) Sutes). Определенное количество лекарственного сырья измельчают на пастообразователе «Волтарь-5». Сок отжимают с помощью серийного пресса ВПРД-5. Отжатое от сока сырье (жом) экстрагируют водой (1:10) при температуре 95—98 °С в течение 15 мин, повторяя операцию 4 раза. Сок и извлечения объединяют, отстаивают, фильтруют. Полученный препарат — прозрачная жидкость, светло-желтого цвета со слабым своеобразным запахом, рН 5,0—6,5. Разливают ампулы по 1 мл, стерилизуют при температуре 110°С 30 мин. Получают препарат и в виде сухого сока, тогда для сушки применяют распылительную сушилку РСЛ-10. Химический состав: около 17 веществ флавоноидной природы, фенолкарбоновые кислоты, кумарины. Применяют как вспомогательное средство для стимуляции обменных и регенеративных процессов в офтальмологической, стоматологической, хирургической и терапевтической практике (при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки). B стоматологической практике (при пародонтозе) применяют в виде аппликаций, электрофореза, инъекций в ткани десен. Выпускают в ампулах по 1 мл, в упаковке по 10 шт. Хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре.
Препараты биогенных стимуляторов животного происхождения. Стекловидное тело (Corpus vitreum). Получают из биостимулированных (по В. П. Филатову) глаз крупного рогатого скота и свиней. Глазное яблоко отделяют от лишних тканей, промывают водопроводной водой, дезинфицируют путем 2 — 3-кратного погружения в 5% раствор карболовой кислоты на 5 мин и доставляют в бокс, где тщательно обливают стерильным физиологическим раствором. Затем скальпелем делают широкий надрез границы наружной оболочки так, чтобы хрусталик остался в верхней части и выдавливают его, стекловидное тело извлекают с помощью вакуум-пистолета и сразу же замораживают. Замороженное в холодильнике стекловидное тело взвешивают в количестве 125 частей на одну загрузку. Дефростацию (обезжиривание) сырья проводят сначала подачей горячей воды в рубашку реактора при перемешивании, а затем — подачей пара. По окончании дефростации стекловидное тело при помощи вакуума помещают в реактор для термообработки. С целью предотвращения пожелтения стекловидного тела в процессе термической обработки в реактор добавляют через люк взвешенные 520 частей угля активированного. Закрывают люк реактора и начинают процесс термообработки — включают мешалку и при перемешивании нагревают стекловидное тело путем подачи пара в рубашку реактора до температуры +115±5 °С, поддерживающейся в течение от 1 до 1,5 ч. Температуру поддерживают автоматически при помощи программного датчика и регулятора. После окончания процесса термообработки в рубашку реактора подается холодная вода для охлаждения содержимого реактора до температуры 85±5 °С. Затем извлечение осветляют в отстойнике и стерилизуют стекловидное тело с помощью слоистого фильтра типа «Орион». Перед началом стерильной фильтрации стерильный фильтр «Орион», состоящий из семи пластин марки EKS, восьми марки КО-5 и дополнительного мембранного фильтра, промывают водой для инъекций в количестве 70 л. Затем систему продувают стерильным чистым воздухом до удаления влаги. Выход стекловидного тела после стерильной фильтрации составляет 80,75% от извлеченного. Готовый продукт — это стерильная, бесцветная, прозрачная, слегка опалесцирующая жидкость, которую разливают в ампулы по 2 мл и стерилизуют при температуре 120 °С в течение 30 мин в паровом автоклаве. Затем выдерживают в термостате 8 дней при температуре 37 °С. Применяют для размягчения и рассасывания рубцовой ткани как обезболивающее средство при невралгиях. Хранят при комнатной температуре. Взвесь плаценты для инъекций (Suspensio Placentae pro injectionibus). Взвесь получают из женской плаценты, ее отбирают в родильных домах от заведомо здоровых рожениц. После сбора плаценту сразу же помещают в стерильную посуду с крышкой и отправляют на завод, где замораживают в холодильных камерах и выдерживают при 2—4 °С в течение 5—7 сут для обогащения тканей плаценты биологически активными веществами. Консервированное сырье переносят в бокс, отделяют околоплодные пузыри, пупочные канатики, ополаскивают водой очищенной, очищают от серозной оболочки и измельчают. Взвешенную массу заливают двумя объемами 0,9% изотонического раствора натрия хлорида в стеклянных банках, которые закрывают ватными тампонами и пергаментной бумагой и завязывают. Баллоны стерилизуют в автоклаве при 119—121 °С в течение часа и оставляют в холодильнике на сутки. Содержимое баллонов пропускают через коллоидную мельницу до получения частиц размером не более 0,3 мм в боксе, предварительно облученном ультрафиолетовыми лучами. Раствор охлаждают в течение 2—-3 ч и передают на ампулирование. Готовый продукт — это гомогенная взвесь красновато-коричневого цвета с характерным запахом, рН 5,8—6,9. Применяют как биогенный стимулятор при различных заболеваниях глаз. Апилак (Apilacum). Сухое вещество нативного пчелиного маточного молочка (секрета аллотрофических желез рабочих пчел). Апилак — это лиофилизированная порошкообразная масса или пористые плитки кремовато-желтого цвета; применяется для приготовления следующих лекарственных форм: - порошок апилака (Pulvis Apilaci) состоит из 7 частей апилака лиофилизированного и 93 частей лактозы; - сублимированные таблетки апилака (Tabullettae Apilaci) содержат по 0,01 г (10 мг) апилака; - свечи апилака (Suppositoria «Apilacum»), содержащие 0,005 или 0,01 г апилака лиофилизированного; в упаковке по 5 свечей; - 3% мазь апилака (Unguentum Apilaci) в тубах по 50 г; - кремы с 0,6% апилака, применяемые при себорее кожи лица, кожном зуде. Применяют при гипотонии нарушения питания у реконвалесцентов, при невротических расстройствах, нарушении лактации в послеродовом периоде, при себорее кожи лица и других поражениях кожи. Препараты из иловой лечебной грязи (минерального происхождения). Пелоидин (Peloidinum). Водный экстракт лечебной грязи из Куяльницкого лимана Одесской области. Технология приготовления. 280 кг лечебной грязи загружают в керамический бак, туда же помещают 720 л воды. На 1000 л смеси прибавляют 6,68 кг натрия хлорида, чтобы получить раствор изотоническим. Смесь настаивают при постоянном перемешивании (с помощью мешалки) от 3 до 6 сут при комнатной температуре, пока отстоявшаяся над грязью жидкость будет иметь плотность 1,008—1,010, содержание хлоридов 11,5—14,5 г/л, сухой остаток до 16 г/л, значение рН 8,2 — 9,5. Затем жидкость сифонируют и дважды фильтруют с целью удаления механических включений (применяя глубинные фильтры) и микроорганизмов (через стерильные пластины или мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,3 мкм). Фильтрат нагревают в течение 1,5 ч при температуре 60—70 °С и после охлаждения в асептических условиях разливают во флаконы по 0,5 л. Хранят в прохладном, защищенном от света месте. Применяют наружно при лечении гнойных ран, промывании и смачивании повязок, а также для лечения методом электрофореза хронических воспалительных заболеваний женских половых органов. Гумизоль (Humisolum). 0,01% раствор фракций гуминовых кислот хаапсалуской морской лечебной грязи в изотоническом растворе натрия хлорида. В препарате находятся биологически активные вещества олигодинамического характера и до 40% гуминовых кислот. Это прозрачная или слегка опалесцирующая со слегка заметной взвесью жидкость с желтоватым оттенком, без запаха, солоноватого вкуса, нейтральной реакции. Терапевтический эффект близок к лечению лечебной грязью. Применяется при хронических и подострых радикулитах, плекситах, невралгиях, ревматоидном артрите, артрозах, хронических заболеваниях среднего уха и придаточных пазухах носа, фарингитах, ринитах. Вводят внутримышечно или же путем электрофореза. Выпускают в ампулах по 2 и 10 мл. ФиБС Для получения препарата используют иловую грязь Куяльницкого лимана и перегоняют с водяным паром. Полученный отгон содержит много серы и водорода сульфида. К полученному отгону, содержащему серу и сероводород, добавляют натрия хлорид (7,3 г на 1 л), отстаивают и фильтруют через тканевой фильтр. Затем проводят сепарацию на жидкостном сепараторе тарелочного типа, при этом образуется прозрачный раствор при производительности 55 л/ч. Сероводород удаляют при нагревании, а натрия хлорид - применением повторной перегонки. К полученному раствору (пелоид) добавляют коричную кислоту (0,3—0,4 г на 1 л) и кумарин (0,1 г на 1 л) и фильтруют. ФиБС — это бесцветная жидкость с запахом кумарина, рН 4,6—5,4. Стерилизуют при температуре 120 °С в течение 1 ч. Применяют для лечения кератита, блефарита, помутнения стекловидного тела, а также артритов, радикулитов и других заболеваний. Выпускают в ампулах по 1 мл. Хранят в защищенном от света месте. Торфот (Torfotum). Отгон торфа из определенных месторождений с определенными показателями. Это прозрачная, бесцветная, стерильная жидкость с характерным запахом торфа. Значение рН 6,0—8,8. Применяют по тем же показаниям, что и ФиБС. Выпускают в ампулах по 1 мл. Вулнузан (Vulnusan). Мазь, содержащая экстракт из маточников поморийских соляных озер Болгарии - 12 г; касторового масла — 35 г; ланолина — 15 г; воды — до 100 мл. Способствует очищению и ускорению заживления поверхностных гнойных ран, трещин (заднего прохода) и др.
52. Препараты из животного сырья. Характеристика. Классификация. Технологические схемы производства. Препараты, получаемые из животного сырья (органов, тканей, крови, мочи и т.д.). известны под названием органотерапевтические или органопрепараты (Medicamenta organotherapeutiea). В зависимости от природы фармакологически активных веществ их можно подразделить на препараты: - гормонов, - ферментов, - препараты неспецифического действия. В зависимости от органа, из которого они получены, различают препараты из: - гипофиза, - поджелудочной, - щитовидной желез, - печени - семенников - надпочечников и т.д. По способу получения и степени очистки их разделяют на: - экстракционные - высушенные, обезжиренные и измельченные железы и ткани для внутреннего употребления - инъекционные. Инъекционные, в свою очередь, подразделяют на: - максимально очищенные экстракты; - препараты индивидуальных веществ.
53.Краткая история развития биотехнологии и периоды развития биотехнологии. Характеристика. Биотехнология лекарственных средств. Человек, рождающийся для познания мира (в том числе — и самого себя), давным-давно освоил на практике различные процес-сы биотехнологии, не зная по существу, что они относились к такому разряду. В самом деле, с библейских времен известно виноделие, тысячелетия насчитывает хлебопечение и т. д. Познавательная деятельностьлюдей непосредственно сказыва-лась на уровне социального развнтия общества. Недаром вторую половину XX столетия мы называем периодом научно-технической революции. Наука сегодня имеет огромное значение в жизни людей, и научный подход к решению любой задачи — веление и требование времени. Наука формировалась и эволюционировала по мере формиро-вания и развития человеческого общества. Это, в частности, не-посредственно относится и к биотехнологии. Ее возникновение, становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода: эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехниче-ский. Эмпирический (от греч. empeirikos — опытный) или доисто-рический период — самый длительный, охватывающий примерно 8000 лет, из которых более 6000 лет — до нашей эры и около 2000 лет — нашей эры. Древние народы того времени интуитивно использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к раз-ряду биотехнологических. Кризис охотничьего промысла (хозяй-ства) стал побудительным мотивом революции в изготовлении продуктов питания. Эта революция началась около 8000 лет назад и привела к изобретению техники земледелия — началу произво-дительного ведения хозяйства (неолит и бронзовый века.) Стали формироваться так называемые приречные цивилизации Месопо-тамии, Египта, Индии и Китая. Шумеры — первые жители Месо-потамии (на территории современного Ирака) создали цветущую в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста, владели искусством готовить пиво. В этом следовали им ассирийцы и вавилоняне, жившие также в Месопотамии, египтяне и древние индусы. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издревле приготавливавшийся в домашних условиях, хотя о микробах — индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря работам Пастера, и это несмотря на существование с XIV в. так называемого "Орлеанского способа" приготовления уксуса; первая дистилляция вина осуществлена в XII в.; водку из хлебных злаков получили в XVI в.; шампанское известно с ХVШ в., но получение почти абсолютного этанола впервые удалось в ХIV в. испанцу Раймунду Луллию (ок. 1235 — 1315) благодаря перегонке вина с негашеной известью. В те древние времена продукты питания растительного и животного происхождения использовались не только в пищу, но и для лечебных целей. Например, в ассирийской столице Ниневии (8 — 7 века до н. э.) была царская библиотека, насчитывавшая более 30 000 клинописньгх табличек, из которых в 33 имелись сведения о лекарственных средствах и их рецептуре, и в самом городе размещался сад лекарственных растений. Ктому же эмпирическому периоду относятся: получение кис-ломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений. Длительное накопление фактов происходило и в области ми-кологии (от греч. myKes — гриб). Сведения о грибах можно найти в источниках древности, а Луции Лициний Лукулл (106 — 56 гг. до н. э.), славившийся богатством, роскошью и пирами ("лукуллов пир"), прсдпочитал всем сьедобным грибам кесарев гриб (Amanita cesarea, L.). Древние евреи хорошо знали ржавчину хлебных злаков и головню. В (V — I веках до н. э. были собраны интересные материалы о грибах, нашедшие отражение в работах Аристотеля, Диоскорида, Плииия Младшего, Теофраста. В последующие века нашей эры микология стала самостоятельной наукой — велика роль в этом Д. Персоона и Э. М. Фриза, по праву считающихся отцами систематической микологии. Таким образом, народы исстари пользовались на практике микробиологическими процессами, ничего не зная о микробах. Эмпиризм также был характерен и в практике использования полезных растений и животных. Второй, этиологический (от греч. aitia — причина) период в развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX века и первую треть XX века (1856 — 1933 гт.). Он связан с выдающимися исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822 — 1895) — основоположника научной микробиологии и ряда микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской, химической, санитарной). С аналитической микробиологией непосредственно связано открытие Пастером молекулярной ассиметрии (стереоизомерии). Это, по существу, бриллиантовыи век микробиологии. Пастер вскрыл микробную ирироду брожений, доказал возможность жизни в бескислородных условиях, экспериментально опроверг ходячее тогда представление о самопроизвольном зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопрофилактики и вакцинотерапии; предложил метод стерилизации, называемый по его имени пастеризацией и т. д. Немеркнущая слава Пастера не затмила имен его выдающихся учеников и сотрудников: Э. Дюкло, Э. Ру, Ш. Э. Шамберлана, Ж. А. Вильемена, И. И. Мечникова. В этот же период творили Р. Кох, Д. Листер, Ш. Китазато, Г. Т. Риккетс, Д. И. Ивановский, А. Лаверан и другие. Параллелъно с Пастером трудился в Германии, а позднее — во Франции, выдающийся миколог А де Бари (1831 — 1888) — основоположник физиологической микологии. Изучив стадии раз-множения и историю индивидуального развития грибов (онтоге-нетический метод), с учетом их взаимоотношений с другими видами, а также цитологических и биологических особенностей, де Бари создал классификацию, которая и сегодня лежит в основе современных классификационных схем микро и макромицетов. Де Бари — основоположник микофитопатологии — науки о грибных болезнях растений (от греч. filon — растение, palhos — болезнь), под его руководством сформировалась плеяда выдающихся ученых (в том числе — из России): Ф. М Бальфур, И. В. Баранецкий, М. Бейеринк, О. Брефельд, М. С. Воронин, А Кох, А. С. Фаминицин и др. В биотехнологии важными являются питательные среды ддя культивирования ряда биообъектов. Уже А Пастер приготовил первую жидкую питательную среду в 1859 году, метод выращива-ниягрибов нажелатине предложил О. Брефельдв 1864 г.г Ж. Ролен сообщил о жидких средах для выращивания нитчатых грибов в 1870 г Р. Коху в 1876 г. удалось вырастать бациллы сибирской язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей коровы. В 80-е годы XIX столетия Р. Кох преддожил метод культи-вирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и затем — на агаризованных питательных средах. В настоящее время, предлагая самые сложные и необычные в каком-либо отношении среды для выращивания биообъектов, мы опираемся на основополагающие результаты этих выдающихся ученых. Аналогичным образом можно сказать и о вариантах способов стерилизации питательных сред, имея в виду тиндализа-цию, кипячение, дробную стерилизацию и др. Все они основыва-лись на необходимости уничтожения посторонней микрофлоры, которая попадала в среды в процессе их изготовления. В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в 1892 г. вируса мозаичной болезни табака Д. И. Ивановским (1864 — 1920). Последовавшие за этим обнаружения других вирусов обеспечили становление новой научной дисциплины — вирусологии. Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах. Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах и использован в целях воспроизведения соответсгвующих процес-сов (бродильных, окислительных и др.). Например, маслянокислые бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лактобак-терии и молочнокислое брожение, дрожжи — сахаромицеты и спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление этано-ла до уксусной кислоты и т. д, В этот период было начато изготовление прессованных пищевых дрожжей, а также некото-рых продуктов обмена (метаболизма) — ацетона, бутанола, лимои-ной и молочной кислот,- во Франции приступили к созданию биоустановок для микробиологической очистки сточных вод. Знание причин биологических процессов еще не исключало нестерилъные операции, хотя и стремились к использованию чистых кудьтур микроорганизмов. Для всестороннего изучения морфолого-физиологических свойств и продуктов обмена, прежде всего, микробов все ранее предложенные способы ихвыращивания оказались малопригод-ными. Более того, накопление однородной по возрасту большой массы клеток оставалось исключительно трудоемким процессом. Вот почему требовался принципиально иной подход для решения многих задач в области биотехнологии. В 1933 году А Клюйвер и Л. X. Ц. Перкин опубликовали работу "Методы изучения обмена веществ у плесневых грибов", в которой изложили основные технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации получаемых результатов при глубинном культивировании грибов. С этого времени начинается третий период в развитии биологи-ческой технологии — биотехнический. Началось внедрение в биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудо-вания, обеспечившего проведение процёссов в стерильных усло-виях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного био-технологического оборудования был отмечен в период становления и развития производства антибиотиков (время второй мировой войны 1939 — 1945 rr.f когда возникла острая необходимость в противомикробных препаратах для лечения больных с инфициро-ванными ранами). Все прогрессивное в области биологических и технических дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое отражение в биотехнологии. Сдедует отметить, что уже в 1869 г.. Ф. Мишер получил "нуклеин" (ДНК) из гнойных телец (лейкоци-тов); В. Оствальд в 1893 г. установил каталитическую функцию ферментов; Т. Леб в 1897 г. установил способность к выживанию вие организма (в пробирках с плазмой или сывороткой крови) клеток крови и соединительной ткани; Г. Хаберланд в 1902 г. показал возможность кулътивирования клеток различных тканей растений в простых питательных растворах; Ц. Нейберг В 1912 г. раскрыл механизм процессов брожения; Л Михаэлис и М. Л. Ментен в 1913 г. разработали кинетику ферментативных рсакций, а А. Каррел усовершенствовал способ выращивания клеток тканей животных и человека и впервые применил экстракт эмбрионов для ускорения их роста; Г. А. Надсон и Г. С. Филлипов в 1925 г. доказали мутагенное действие рентгеновских лучей на дрожжи, а в 1937 г. Г. Кребс открыл цикл трикарбоновых кислот (ЦТК); в 1960 г. Ж. Барски и др. впервые обнаружили соматические габриды опухолевых клеток мыши. Следовательно, накопленные научные факты стали побудительным мотивом для разработки способов крупномасштабного культивирования клеток различного проис-хождения. Это, яеобходимобылодляпблученияразличных клеточ-ных продуктов и самих клеток для нужд человека, и, прежде всего, в качестве или в составе лечебных и профилактических средств: пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда ами-нокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно (Франция) разработал теоретические основы непрерывного управляемого культивирования микробов; в 50-е годы вопросам практической реализации непрерывного культивирования микроорганизмов по-святили свои исследования М. Стефенсон, И. Малек, Н. Д. Иерусалимский и др. Примерно за 40 дет третьего периода были решены основные задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику необходимого оборудованйя, в том числе главного из них — биореакторов. Это оборудование используют и в настоящее время. Четвертый период в биотехнологии — генотехнический (от греч. genesis — происхождение, возникновение, рождение) начал-ся с 1972 г. В этом году П. Берг со своими сотрудниками в США создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако следует отметить, что в 1969 г. Дж. Бекуит с колдегами выделил в химически чистом виде лактозный ген из кишечной палочки, показав тем самым возможиость направленных манипуляций с генетическим материалом бактерий. Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж. Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозмож-ным достигнуть современных результатов в области биотехноло-гии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНКГ выделение и изучение специфичных ферментов привело к фор-мированию строго научного подхода к разработке биотехнологи-ческих процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть генотехнического периода.
54.Области применения моноклональных антител. Методы анализа, основанные на использовании моноклональных (поликлональных) антител. Чем же замечательны продукты гибридных моноклонов — моноклональные антитела? Чем они отличаются от обычных сывороточных антител, получаемых со времен Пастера? Моноклональные антитела это продукты потомков одной-единственной, само по себе особенной В-клетки и поэтому препараты моноклональных антител характеризуются следующими особенными свойствами, вытекающими из небывалой степени биохимической гомогенности: — моноклональные антитела высокоспецифичны. Они направлены только против одной малой части сложных молекул антигенов, все — против одной и только одной и той же антигенной детерминанты; — моноклональные антитела стабильны как эталоны в отношении специфичности и аффинности (прочности связи с антигеном). Существенно, что исследователь может целенаправленно подобрать моноклон, вырабатывающий антитела только нужного «сорта», т. е. класса, подкласса, специфичности, аффинитета. Известно, что в организме вырабатываются минимальные количество антител классов ІgЕ (участвующих в аллергических реакциях) и ІgD.Методом гибридизации моноклональные антитела этих классов можно получить в неограниченных количествах. Традиционные сывороточные антитела при любых схемах иммунизации представляют из себя смесь молекул антител, весьма гетерогенных по специфичности, аффинности и классовой принадлежности, что имеет следствием практически неизбежную перекрестную реактивность иммунных сывороток с разными антигенами. Перекрестная реактивность делает трудным или невозможным идентификацию уникальных антигенов. Только с помощью моноклональных антител стала возможной, например, диагностика уникального антигена, одной из самых злокачественных опухолей человека — меланобластомы. Чтобы наше изложение не превратилось в упрощенную апологию гибридом, заметим, что поликлональность, гетерогенность сывороточных антител, образующихся в организме животных и человека, отнюдь не недостаток с эволюционной точки зрения. Например, продукция разных антител против разных антигенных детерминант одной целой молекулы антигена увеличивает вероятность образования комплексов антиген — антитело, эффективно выводимых из организма. Это несомненный выигрыш в резистентности, например, к бактериальным и вирусным болезням. Медицина, в отличие от эволюции, работает с каждым индивидуальным организмом как с самоценным. Моноклональные антитела, в отличие от поликлональных сывороточных, обещают стать средством тонкой диагностики и лечения с минимумом побочных эффектов (а в идеале без побочных эффектов) патологически измененной иммунной системы организма.
55.Моноклональные антитела в медицинской диагностике (тестирование гормонов, антибиотиков, аллергенов и т.д.). Моноклональные антитела в терапии и профилактике (перспективы высокоспецифичных вакцин, иммунотоксинов). Включение моноклональных антител в оболочку липосом. Многие задумываются над вопросом, каковы пер-спективы практического применения гибридных кле-ток и моноклональных антител». В самых пессимистических оценках содержится мнение, что гибридомы и моноклональные антитела изменят лицо им-мунологии и многих разделов биологии, существеннейшим образом улучшат иммунодиагностику болезней человека и животных, но что с их помощью все же не удастся добиться радикального перелома в деле иммунотерапии опухолевых, вирусных и бактериальных заболеваний. Наиболее трудными являются оценка результатов и прогнозирование перспектив в приложении к он-кологии. Определенный прогресс наметился в области обнаружения и диагностики опухолевых антигенов. Мы упоминали об обнаружении уникального антигена меланобластом человека и диагностики этой группы опухолей. По-видимому, в ближайшем будущем бу-дут предприняты попытки терапии меланобластом с помощью этих моноклональных антител. Получены моноклональные антитела к опухолевым антигенам мышиного лейкоза Ь-1210, карциномы молочной же-лезы крыс и человека. Доказана принципиальная возможность обнаружить очаги опухоли в организме с помощью радиомеченных моноклональных антител. Однако основным препятствием для широкого исполь-зования моноклональных антител в онкологии, по-видимому, окажутся не недостатки новой биотехноло-гии, а исключительное многообразие опухолевых ан-тигенов. Так, нотки сомнения прозвучали недавно в сообщении группы авторов: не придется ли получать моноклональные антитела против опухолевых анти-генов каждого отдельного больного. Эти авторы пред-лагают следующие ориентировочные расчеты: 1 мг моноклональных антител способен убить опухоль весом 3,2 г. Появились первые сообщения о лечении человече-ских лимфом с помощью моноклональных антител против опухолевого антигена. В опытах in vitro удается избирательно уничтожить опухолевые клетки человека антителами, к которым присоединены ток-сины. В работе сообщили об излечении мышей АКК с перевивным Т-лейкозом моноклональными ан-тителами против не опухолевого, а дифференцировоч-ного антигена Тnу-1,1.
56.Ферменты, используемые в генетической инженерии. Последовательность операций при включении чужеродного гена в векторную плазмиду. Перенос вектора с чужеродным геном в микробную клетку. Работы в области генетической инженерии включают четыре основных этапа; 1) получение нужного гена; 2) его встраивание в генетический элемент (вектор), способный к репликации; 3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент; 4) идентификация (скрининг и селекция) клеток, которые приобрели желаемый ген (гены). Рассмотрим по отдельности каждый этап. Получение генов. Получить нужный ген можно: а) выделением его из ДНК; б) путем химико-ферментативного синтеза; в) воссозданием на основе изолированной матричной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы). Преимущество рассматриваемого метода состоит в том, что ген получается без интронов и других нетранскрибируемых последовательностей. Помимо этого, легче создать условия, когда клетка аккумулирует нужный вид мРНК, чем отбирать ген из смеси фрагментов ДНК- Большим успехом в применении метода, основанного на РНК-зависимом синтезе ДНК, является получение в 1979 г. гена гормона роста человека (соматотропина), Введение гена в вектор. Ген, полученный тем или иным способом, содержит информацию о структуре белка, но сам по себе не может реализовать эту информацию. Нужны дополнительные механизмы, управляющие действием гена, поэтому перенос генетической информации в клетку осуществляется в составе векторов. Векторы — это, как правило, кольцевые молекулы, способные к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором образует рекомбинантную ДНК. Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы. Различают два основных класса векторов: вирусы и плазми-ды. Важной проблемой, возникающей при использовании вирусов в качестве генетических векторов, является их аттеньюа-ция — ослабление патогенности для хозяина, чтобы зараженные вирусом клетки выживали и могли передать потомству измененную генетическую программу. Большое значение для биотехнологии имеет способность вирусов быстро транспортироваться из клетки в клетку, распространяясь по растительной или животной ткани так, что в короткие сроки развивается генерализованная инфекция по всему организму. Такое свойство вирусов открывает возможность генетической модификации соматических клеток взрослого организма. В этом отношении открываются перспективы лечения наследственных заболеваний человека путем введения вирусов, разносящих недостающие гены по всем клеткам человеческого тела. Плазмиды — автономные самореплицирующиеся генетические единицы, найдены у бактерий, грибов, растений и животных. Наибольшее применение в генетической инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды Е. coii. Бактериальные плазмиды подразделяются на конъюгативные, т. е. способные к переносу генетической информации от клетки к клетке путем конъюгации бактерий, и неконъюгативные, передающиеся от одной клетки к другой посредством механизма бактериальной трансформации. Перенос неконъюгативных плазмид путем конъюгации возможен только в том случае, если имеется плазми-да-помощник, способная к самостоятельному транспорту. Некоторые плазмиды способны к амплификации, т. е. образуют в клетке большое число копий, что резко повышает уровень фенотипиче-ского выражения генов. При конструировании векторов исследователь вводит в него участки узнавания рестриктаз, а также гены-маркеры, кодирующие легко распознаваемые признаки. По этим признакам можно отобрать клетки, являющиеся носителями вектора. Большой интерес представляют космиды — плазмиды, в состав которых введен cos-участок ДНК фага К Е. со//, отвечающий за упаковку ДНК в фаговую частицу. Такие плазмиды способны передавать очень большой объем генетической информации (до 10 тыс. пар азотистых оснований), рекомбинантные ДНК могут быть упакованы в фаговые частицы.
|
