Пептидные факторы роста тканей

В группе пептидных факторов роста тканей собраны пептиды, исследованные мало в сравнении с выше описанными группами. Эти вещества являются, как правило, факторами, регулирующими активность белковых гормонов или влияющими на рост и функции отдельных тканей организма. По химической структуре - в основном крупные олигопептидные молекулы, часто с не вполне идентифицированной структурой. Среди общих функций пептидных ростовых факторов - стимуляция митоза, дифференцировки и роста клеток различных тканей; ускорение заживления ран; ростовые факторы причастны к развитию онкообразований; связаны с функцией других физиологически активных соединений.

Пептидные биорегуляторы (факторы роста) специфичны к рецепторам определенных клеток, причем набор таких пептидов весьма широк, что дает возможность осуществить стимуляцию самых различных тканей и органов. В случае нарушений функции печени в НИЛРЦ "Институт биологической медицины" используются пептидные факторы, стимулирующие гепатоциты. Как правило, такое лечение проводится в комплексе с другими биорегуляторными препаратами, в частности регулирующими кроветворение (органы-мишени - костный мозг и лимфоузлы) и нормализующими гормональный статус (органы-мишени - эпиталамус и гипофиз). Представленные данные позволяют сделать следующий основной вывод, который к настоящему времени подтвержден на значительном количестве больных: коррекция функции печени при лечении пептидными биорегуляторами (факторами роста) проходит успешно, происходит нормализация значения коэффициента атерогенности, уровня билирубина и аминотрансфераз в сыворотке крови больного.

70. Иммунобиотехнология как один из разделов биотехнологии. Вакцины и сыворотки. Получение и области применения моноклональных антител

. Иммунобиотехнология это новое направление иммунологии, разрабатывющие получение высокоэффективных диагностических и лечебных средств на их основе биотенологии

Для специфической профилактики и лечения инфекционных заболеваний большое значение имеют вакцины и иммунные сыворотки. Специфические иммунные сыворотки используют также как диагностические препараты при определении антигенной структуры возбудителя инфекционного заболевания.

 

Вакцины. Препараты, введение которых предохраняет от заболевания. Содержат убитые микробы (корпускулярные вакцины), антигены микробов, полученные химическим путем (химические вакцины), или живые ослабленные микробы (аттенуированные вакцины). Препараты, приготовленные из токсинов, называют анатоксинами. Наилучший защитный эффект получают при введении вакцин, содержащих живые ослабленные микробы.

Сывороточные препараты. Специфические иммунные сыворотки содержат антитела (иммуноглобулины) к определенным видам микроорганизмов. Сывороточные препараты используют для лечения, так как введение в организм антител обеспечивает быстрое обеззараживание микробов и их токсинов. Иммунные сыворотки применяются также с диагностической целью для определения антигенного состава микроорганизма, выделенного от больного, что позволяет установить вид (тип) микроба. Сывороточные препараты используют и в профилактических целях для быстрого создания невосприимчивости у человека, контактировавшего с больным или с инфицированным материалом. Специфическую иммунную сыворотку вводят, например, детям, имеющим контакт с больными корью или инфекционным гепатитом (болезнь Боткина). При наличии раневых поверхностей вводят противостолбнячную и противогангренозные сыворотки. При введении сыворотки для профилактики столбняка или бешенства ее комбинируют с активной иммунизацией анатоксином или вакциной. Введение сыворотки в организм человека создает пассивный иммунитет.

 

71.Интерлейкины. Механизм биологической активности. Перспективы практического применения.

Развитие методов клонирования генов в значительной мере облегчило продукцию высокоочищенных цитокинов всех типов и идентификацию большинства интерлейкинов (ИЛ).

Главным из цитокинов являются ИФНу и ИЛ-2. ИФНу - ключевой медиатор активации системы естественной цитотоксичности, регулирует процесс дифференцировки естественных киллерных клеток и их цитотоксическое взаимодействие с клетками-мишенями, стимулирует цитотоксические и регуляторные функции макрофагов, активирует цито-токсические лимфоциты. Под действием ИФНу повышается продукция цитокинов, таких, как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-12, ИФНр, и фактора некроза опухолей-а. ИЛ реализуют эффект через рецепторы на поверхности соответствующих клеток-мишеней.

Интерлейкины—сравнительно короткие (около 150 аминокислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа.

Многие ИЛ проходят стадию клинического изучения, другие - нашли разнообразное применение в лечении инфекций, воспалительных, аутоиммунных и неопластических расстройств. Так, ИЛ-1 показан для лечения воспалений и септического шока, ИЛ-2 включен в схемы лечения имуногенных опухолей (меланомы, почечноклеточного рака, рака мочевого пузыря).

Интерлейкин-1, образующийся определенной группой лейкоцитов крови — макрофагами, в ответ на введение антигена стимулирует размножение (пролиферацию) Т-хелперов (субпопуляции Т-лимфоцитов), продуцирующих, в свою очередь, интерлейкин-2. Последний вызывает пролиферацию различных субпопуляций Т-лимфоцитов - Т киллеров, Т-хелперов, Т-супрессоров, а также В-лимфоцитов, продуцентов антител. Под влиянием интерлейкина-2 из Т-лимфоцитов высвобождаются регуляторные белки — лимфокины, активирующие звенья иммунной системы; синтезируются также интерфероны.

Интерлейкины, основные лечебные средства при иммунных расстройствах, получают путем клонирования соответствующих генов в Е. соli или культивирования лимфоцитов in vitro. Английская и японская компании предлагают синтезированный генноинженерными бактериями интерлейкин-1 наряду с другим полипептидным агентом —фактором некроза опухолей ~ для лечения ряда опухолевых заболеваний.

Специфический ген человеческого ИЛ с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид (участок гибридной белковой молекулы, облегчающий идентификацию и очистку белка), переносят в микробные клетки-продуценты, где экспрессируется химерный белок (продукт клонированного гена, защищенный одной или несколькими аминокислотами от расщепления протеиназами клетки-хозяина). Конструирование рекомбинантных молекул ИЛ осуществляется набором специфичных ферментов. Маркерный пептид, входящий всостав химерного белка, очищают иммуноафинной хроматографией.

Получаемые биотехнологическим путем факторы свертывания крови, особенно фактор VIII (с помощью культивируемых клеток млекопитающих) и фактор IX (с помощью генноинженерного штамма Е. соli), необходимы для терапии форм гемофилии наследственной болезни, при которой кровь теряет способность свертываться. К числу ценных с клинической точки зрения факторов, полученных в биореакторах с культурами животных клеток, следует отнести фактор роста В-лимфоцитов, фактор активации макрофагов, Т-заместительный фактор, активатор тканевого плазминогена.

72Нанотехнология — это работа с веществом на уровне отдельных молекул и атомов, манипуляция которыми может привести к созданию достаточно сложных объектов, чья структура может быть описана с точностью до одного атома.

По определению ведущего ученого в данной области Р. Фрейтаса, наномедицина — это слежение, исправление, конструирование и контроль биологических систем человека на молекулярном уровне с использованием разработанных наноустройств и наноструктур. Наномедицина пока еще только зарождается, но уже существуют нанопроекты, воплощение которых в медицину, в конечном итоге, даст результат. Ближайшие перспективы применения нанотехнологий в медицине и фармации могут рассматриваться во взаимодействии дисциплин по созданию молекул, нанотехнологий твердых веществ, микроэлектроники, микроэлектромеханических (microelectromechanical systems — MEMS) и микрооптикоэлектромеханических систем (microopticalelectromechanical systems — MOEMS).

Нанотехнология может стать гигантским шагом человечества на пути к созданию новых приборов и препаратов для лечения множества заболеваний, а возможные медицинские достижения, которые станут доступными с помощью нанотехнологии, простираются от диагностики до терапии.

Такие технологии позволят применять новую диагностическую технику, более специфическую терапию и местное применение лекарства, которое увеличивает эффективность, медленно увеличивает сопротивляемость к нарушениям и снижает нагрузку токсичными компонентами на организм человека. По мнению ученых, количество целевых зон для лекарственных препаратов, которые будут выявлены в результате исследования генома человека, может составить от 3.000 до 10.000 (по сравнению с 417, эмпирически полученными в настоящее время).

Кроме того, детальное понимание взаимодействия между генами, молекулярным движением и болезнью может дать возможность создания высокоспецифичных, индивидуальных лекарственных препаратов.

Вероятно, что фармацевтическая отрасль будет переходить от парадигмы исследования медикаментов через сочетание различных компонентов в препарате к целевой инженерии молекул с заданными свойствами. В ближайшее время предполагается создание нанолекарств, которые будут доставляться кровопотоком непосредственно к больному органу человека, что увеличит эффективность его использования и снизит побочные эффекты.

По оценке специалистов, основными сферами медицины и фармации, которые затронет нанотехнология, станут доставка лекарственных средств, создание искусственных тканей организма, диагностика и индикация препаратов.

 

73.Методы получения β- интерферона при культивировании фибропластов.

Интерферон открыт А; Айзексом и Дж. Линдеманом в 1957 г. в клетках цыпленка, зараженных.вирусом гриппа. Это видоспецифическое белковое вещество, синтезируемое лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногенов. Применительно к млекопитающим и, прежде всего, человеку под названием "лейкоциты" объединяют все белые клетки крови (от греч. leikos —. белый, kytos —^L ячейка, клетка) — сегментоядерные лейкоциты (нейтрофильные, эозинофильные, базофильные), или микрофаги, лимфоциты (Т и В) и моноциты. Все эти клетки являются ядерными и участвуют в обеспечении постоянства внутренней среды макроорганизма (гомеостаза), включая неспецифическую и специфическую_защиту, или-йммунитет. Однако.сегментоядерные лейкоциты относят к разряду полинуклеарных, тогда как моноциты — к разряду мононуклеарных. Мононуклеарными фагоцитами (наравне с моноцитами) являются также гистиоциты, или'макрофаги. К ним относят макрофаги соединительной ткани, звездчатые клетки Купфера в печени, альвеолярные макрофаги в легких, свободные- и фиксированные "макрофаги в лимфоузлах и селезенке, гистиоциты в коже, остеокласты в костной ткани, фиксированные макрофаги в костном мозге, макрофаги в серозных полостях (плевральной и брюшной); макрофаги в нервной ткани (клетки микроглии).

С учетом топологии и/или функции макрофаги подразделяют еще на резидентные, эксудативные (макрофаги воспалительного эксудата), активированные, индуцированные.

Моноциты, макрофаги и их предшественники объединены в так называемую систему мононуклеарных фагоцитов (СМФ). Генеалогия (от греч. genea — рождение, происхождение, logos — обсуждение) клеток крови изучена достаточно глубоко.

Лейкоциты и другие клетки млекопитающих, в частности, при заражении вирусами продуцируют не один интерферон, а больше, объединяемых в семейство интерферонов, ингибирующих продуктивный цикл репликации вирусов. Вот почему они являются оружием первой линии защиты против вирусных инфекций.

Однако в обычных (неиндуцированных) клетках интерфероны не выявляются; интерфероны b и g являются гликопротеинами, тогда как интерферон α — протеином.

Интерфероны — клеточные белки и поэтому они видоспеци-фичны, то есть каждому виду животного свойственен свой интерферон, но не являются вирусоспецифическими. При смешанной вирусной инфекции один вирус подавляет другой за счет интерфероногенности первого — феномен вирусной интефе-р е н ц и и. Иногда эта видоспецифичность очень узкая, например, для курицы, утки, мыщи и крысы, но не перекрестно в группах птиц и грызунов или между группами. Однако есть исключения — человеческий интерферон защищает клетки крупного рогатого скота лучше, чем коровий интерферон.

Человеческие интерфероны α и b продуцируются преимущественно лейкоцитами, В-димфобластами и соединительнотканными клетками мезенхимного происхождения — фибробластами в ответ на вирусную инфекцию. Интерферон у прежде называли иммунным, или тип 2; он образуется несенсибилизированными лимфоидными клетками Т-лимфобластами в ответ на митогены, и сенсибилизированными лимфоцитами при стимуляции специфическими антигенами.

Механизмы индукции интерферона до конца еще не изучены и трудно объяснить почему, например, двухнитевые РНК стимулируют образование интерферона, а двухнитевая ДНК не обладает аналогичным действием.

На практике интерферон-α выделяют из лейкоцитов при низкоскоростном центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в культуральную среду, содержащую либо сыворотку крови человека или казеин молока, в среду вносят вирус — интерфероноген (вирус Сендай или вирус ньюкаслской болезни), выдерживают в течение ночи, после чего лейкоциты отделяют центрифугированием, вирус — интерфероноген инактивируют любым из приемлемых способов. Супернатант (от лат. supematans — плавающий на поверхности), или надосадок представляет собой нативный интерферон. Его лиофильно высушивают и выпускают в ампулах. Это — пористый, серовато-коричневый порошок, легко растворимый в воде. Растворенный препарат имеет розовато-красноватый цвет и слегка опалесцирует. Из нативного интерферона можно получить концентрированный интерферон путем очистки колоночной хроматографией на сефадексах. Полученный препарат после высушивания имеет вид пористого порошка серовато-белого цвета, хорошо растворимый в воде. Тот и другой интерфероны должны быть стерильными.

Активность препаратов определяют титрованием на первичных культурах клеток, например, кожно-мышечной ткани эмбриона человека с вирусом везикулярного стоматита. Противовирусная активность (так называемая удельная активность) нативного интерферона должна быть не менее 32 единиц, концентрированного — 100 единиц. Для очистки интерферона можно прибегнуть и к высоко эффективной жидкостной хроматографии.

 

74.Биополимеры, характеристика, микробиологический метод получения.

Биополимеры - структурная основа живых организмов. К ним относят белки, РНК, ДНК и др.

Белок - высокомолекулярное органическое соединение, построенное из остатков 20 аминокислот и играющее первостепенную роль в процессах жизнедеятельности всех организмов. Молекулярная масса белков — от примерно 5000 до многих миллионов. Белки выполняют структурную (построение тканей и клеток, их составных частей), функциональную (ферменты, гормоны, дыхательные и др. пигменты и т. п.) роль. Белки чрезвычайно разнообразны, например в организме человека свыше 10 млн различных белков. Разнообразие белков обусловлено различной последовательностью аминокислотных оснований, разной длиной полипептидной цепи, многообразной пространственной их структурой и т. п. Различают четыре уровня структурной организации белков: первичный — последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи, вторичный — укладка полипептидной цепи в спиральные участки и особые структурные образования, третичный — трехмерная пространственная упаковка полипептидной цепи и четвертичный — ассоциация неск. отдельных полипептидных цепей в единую структуру. Общепризнанной всеобъемлющей классификации белков пока не создано. Постоянное обновление белков лежит в основе обмена веществ. Основную роль в биосинтезе белков играют нуклеиновые кислоты. Поскольку многие аминокислоты, из которых состоит белки, организмом человека не синтезируется, он нуждается в поступлении белков с растительной, а иногда и с животной пищей.

ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) -высокомолекулярное соединение, содержащееся в ядрах клеток организмов и вместе с белками гистонами образующее вещество хромосом. ДНК — носитель генетической информации, ее отдельные участки соответствуют определенным генам. Молекула ДНК состоит из двух полинуклеотидных цепей, закрученных одна вокруг другой в правовитковую спираль. Цепи построены из большого числа мономеров четырех типов нуклеотидов (дезоксирибонуклеотидов), специфичность которых определяется одним из четырех азотистых оснований — аденином, гуанином, цитозином и тимином (в них входит также дезоксирибоза и остаток фосфорной кислоты).

Азотистые основания нуклеотидов, будучи комплементарно связаны друг с другом, соединяют полинуклеотидные цепи в макромолекулу ДНК. Сочетания трех рядом стоящих нуклеотидов в цепи (триплеты, или кодоны) определяют генетический код, а их последовательность — характер генетической информации. Способность ДНК к самоудвоению обеспечивает генетическую преемственность между поколениями организмов в процессе размножения. Расстояние между парами комплементарных оснований по длине спирали равно 0,34 нм. В одном ее витке размешается 10 пар оснований (3,4 нм)» Диаметр спирали равен 2 нм. Макромолекула ДНК состоит из 10—15 тыс. и более дезоксири-бонуклеотидов. У каждого вида организмов ДНК характеризуется специфическим распределением и количественным молярным соотношением азотистых оснований. Все это дает практически неисчерпаемое разнообразие вариантов, для разных организмов, оцениваемое феноменальными числами 10⁵⁰— 10¹⁰⁰⁰, в крайних выражениях значительно превышающими число атомов во Вселенной. Нарушение последовательности нуклеотидов в цепи ДНК приводит к наследственным изменениям в организме — мутациям. Искусственные целенаправленные изменения последовательности нуклеотидов позволяют получать формы с заданными качествами, что используется в генной инженерии и биотехнологии.

РНК (рибонуклеиновая кислота) — высокомолекулярные органические соединения, тип нуклеиновых кислот. РНК образованы нуклеотидами, в которые входит аденин, гуанин, цитозин, урацил и сахар рибоза (в ДНК вместо урацила — тимин, а вместо рибозы — дезоксирибоза). В клетках всех живых организмов участвуют в реализации генетической информации. Различают три основных вида РНК — матричные, или информационные (м-РНК, или и-РНК), транспортные (т-РНК) и рибосомальные (р-РНК). У многих вирусов (так называемых РНК-содержащих) вещество наследственности. Рибосомальные РНК, благодаря которым строятся белковые молекулы, а также митохондриальные и ядерные составляют подавляющую часть РНК клетки (ок. 80%). Транспортные РНК (т-РНК), которых известно около 60 форм, переносят активизированные аминокислоты к рибосомам — пунктам построения белковых макромолекул. Информационные (матричные) РНК (и-РНК, м-РНК) несут в последовательности триплетов своих нуклеотидов запись первичной структуры белковых молекул.

 

75.Жирорастворимые витамины (эргостерин и витамины группы Д). Продуценты и схема биосинтеза.

Витамины представляют собой группу незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимых любому организму в ничтожных концентрациях и выполняющих в нем каталитические и регуляторные функции. Недостаток того или иного витамина нарушает обмен веществ и нормальные процессы жизнедеятельности организма, приводя к развитию патологических состояний. Витамины не образуются у гетеротрофов. Способностью к синтезу витаминов обладают лишь автотрофы, в частности растения. Многие микроорганизмы также образуют целый ряд витаминов, поэтому синтез витаминов с помощью микроорганизмов стал основой для разработки технологий промышленного производства этих биологически активных соединений.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов— продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: β–каротин (провитамин A) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов.

Получение β-каротина и витамина D₂. Важное место в обмене вешеств у животных занимает β-каротин, который в печени превращается в витамин A (ретинол). B организме человека и животных каротины не образуются. Основные источники β-каротина для животных — растительные корма; человек получает β-каротин также из продуктов животного происхождения. β-каротин можно выделить из ряда растительных объектов — моркови, тыквы, облепихи, люцерны. B начале 60-х годов XX в. разработана схема микробиологического синтеза β-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. Установлено, что многие микроорганизмы — фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. Характерно, что содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora — 3 — 8 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза β-каротина, основной недостаток которых — высокая стоимость сырья и большая длительность процесса.

Микробиологическим способом получают и витамин D2 (эргокальциферол), при производстве которого освоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.

B ближайшие годы ожидается расширение набора витаминов, получаемых методами биотехнологии. Для решения проблемы промышленного получения витаминов требуется внедрение непищевого малодефицитного сырья, разработка специальных режимов культивирования сверхпродуцентов, перевод процессов на непрерывные технологии, использование перспективных химико-ферментативных способов синтеза витаминов.

 

76.Каротиноиды и их классификация. Схема биосинтеза. Образование из каротина витамина А.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов— продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: β–каротин (провитамин A) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов.

Получение β-каротина. Важное место в обмене вешеств у животных занимает β-каротин, который в печени превращается в витамин A (ретинол). B организме человека и животных каротины не образуются. Основные источники β-каротина для животных — растительные корма; человек получает β-каротин также из продуктов животного происхождения. β-каротин можно выделить из ряда растительных объектов — моркови, тыквы, облепихи, люцерны. B начале 60-х годов XX в. разработана схема микробиологического синтеза β-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. Установлено, что многие микроорганизмы — фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. Характерно, что содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora — 3 — 8 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза β-каротина, основной недостаток которых — высокая стоимость сырья и большая длительность процесса.

 

77.Проблемы трансформации стероидных структур. Микробиологический синтез гидрокортизона.

В областн превращеиий стероидных соединений достоинства биологичсских катализаторов проявляются наиболсе ярко. Долгое время мнкробиологическая трансформация считалась специфическим методом химии стероидов.

Первые сообіцения о трансформации стероидов микроорганизмами появились задолго до того, как было установлено строение основных представителей стероидов. Еіце в конце XIX в. было известно, что бактериальная флора кишсчника млеколитающих превращает холестерин в копростерин, а холевую кислоту — в дезоксихолевую. К 1913 г. относится открытие полного расщепления холестерина микобактериими. И лишь в 30-х годах, когда была установлена структура основных стероидных гормонов, известных к тому времени, начались попытки применять трансформирующую способность микроорганизмов для препаративного получения этих соединений. В 1948 г. впервыс осущесгвлсно введение гидроксильной группы в молекулу стероида мнкробилогическим путем. Но только после получення -гидроксипрогестерона из прогестерона нри фсрментации последнего с культурой Rhizopus nigricans микробиологические трансформацин стероидов привлекли широкое внимание. Данная трансформация ярко иродемонстрировала преимушества микробиологических методов перед химическими: ввсленне кислородной функции в определенное положение молекулы стероида (С-11) в случае химнческого синтеза представляло необычайно трудную задачу и требовало многочнсленных химических операций, здесь же оно заменялось единсгвенной стадией ферментативного гидроксилирования. Открытие в эти же годы терапевтической ценности кортизона иаряду с указанными успехамн микробиологического процесса гидроксилирования привлекло огромное внимание микробиологов, химиков и врачей к данной области. Внедрение микробиологического синтеза в процеесы получения стероидных гормональных препаратов вызвало переворот в фармацевтической промышленности. по-зволив сразу во много раз удешевить ценные препараты.

Природные стернны — сырье для получення ценных лекар-ственных препаратов.

Большой класс стероидов характеризуется наличнсм в молекуле спсцифического циклического скелета — циклопентанпергидрофенантрена, построенного нз четырех колец, три из которых шесгичленные (А, В и С) и одно - пятичленное (D). Для обозначения различных положений этого кольца принята следу-ющая нумерацня. К стеринам (стеролам) относятся стероиды, несущие в положении С-3 гидроксильную группу.

Холестерин принимает участие в физиологических процессах, пронсходящих в живой клетке, без его участия не может развиваться растущий организм. Желчные камни человека на 99% состоят из холестерина, богаты этим соединснием надпочсчники и другие органы. СпинноЙ мозг и мозг рогатого скота прсдставляст собой наилучший материал для промышленного получения холестерина. Он считался специ-фическим животным стерином до тех пор. пока он не был обна-ружен в некоторых растениях и в морских красных водорослих. Точная структурная формула этого соединения была установлена лишь в 1932 г., хоти впервые он был выделен из жслчных камней в 1782 г.

Другие стерины встречаюшиеся в природе, отличаются от холестерина или по длине боковой цепи, или по степени на-сыщенности.

Стерины растений (фитостерины). Очень важный класс соединений, они служат источником получеиия многих ценных стероидных препаратов.

Ситостерины встречаются в хлопковом и талловом маслах, в зародышах пшеницы и натуральиом каучуке, в сахарном трост-нике и другом растителыюм материале. Коммерческим источ-ником ситостеринов чаще всего являются тростник и хлопковое масло. Ситостерииы и стигмастерин — наиболее перспсктивные и дешевые исходные продукты для получения стсроидных гормонов.

Стсрины необходимы для оеушествления фнзиологических и биохимнческих функний живого организма. Преднолагается, что стсрины требуются для образования мембраиных систем, клеточ-ных оболочек и других етруктуриых образонаний клетки. Есть данные о том, что етерины являются защнтным фактором против токсического действия многих природных соединений.

Основные пути биосинтеза стероидных гормоиов нз холесте-рнна. В органнзме животных и человека из холсетсрииа образуются три важные груипы гормонов: прогестины, половые гормоны н гормопы коры надпочечииков (кортнкостероиды).

При образованин стероидных гормонов из холестерина сначала образуется прегненолон — основной промежуточный продукт бносинтеза стсроидов и кортикостероидов. Окисление З–ОН-груп-пы прегненолона в СО сопровождаетея перемещением двойной связн; продуктом этой кетостероидизомеразной реакции ивляется прогестерон — гормон плаценты и желтого тела.

Прегненолон является также нредшествеиником мужскнх гормоноп (тсстостерона) и жснских половых гормовов (эстроіенов — эстрадиола). В коре надпочечииков прогестерои нревращаетсн в кортнкостерон и кортизол (гидрокор тизон),: секреции кортизола достигает у взроелого человека 15—30 мг в день. Эти веіцества были первоначально выделсны из коры надпочечников в кристаллическом ннде.

Кортилол (гидрокорти.чон) н сго еинтетические аналоги такие, как преднизолон или дексаметазон, нрннадлежит к числу современных средств экстренной терапнн, благодаря их уникаль-ному противовоспалнтелыюму. десенеибилизирующему и пррти-вошоковому действию. По своему химичсскому строению они могут быть разделены на 11-дезоксистероиды, П-гидроксистероиды, 11,17-дигндроксистеронды (к иослсдним относятся кортизои и гидрокортизон).

Основные микробиологические иревращенин стероидов.

Промышлснный сингез названных выше ценных лекарственных препаратов стал возможеи только с развитием методов микробиологической хнмии и, в частноети, мегода микробиологической траисформацші. В качестнс сырья для получения указанных лекарствениыч средств иепользустся диосгенин (из растения диоскореи), стигмастерин из соевых бобоп, в поеледние годы интенсивно изучается р*ситостерин как потенциально дешевый и доступный источник.

.Модифицированные тсм или ішым способом стсроиды сами моіут служить субстратами для ировсдсния соответствующих целенаправленных трансформаций. Так, например, ключевым вешеством в синтезе гидрокортизоиа, кортизона и преднизолона служит «вещество S». Оно, в свою очерсдь, является моднфицированным продуктом биогрансформации моноацетата «вещества R» (2І-ацетат-5-прегнен–ІЗр, 17а. 2І-триол-20-он) с помошыо культуры Corynebacterium mediolanum:

Процесс фермеитативного превраіцення моноацетата веще-ства R в вещество S Рейхштейна с номощью культуры Согуп. mediolanum состоит иэ гидролнза 21-ацстогруппы и окисления Зр-гидроксигруппы в 3 кетогрупну с одновременной миграциеЙ двойной связи. Трансформация заканчивастся практически количествениым выходом веществя S Рейхштейна, носкольку для культуры Coryn. mеdiolanum нехарактерны реакции расщеплепия стероидной молекулы. Это имеет принципиальное значение в производстве кортикостероидных препаратов, поскольку стадия получения вешества S Рсйхштейна является ключевой и в значительной степени определяет конечный выход готовых продуктов следуюших трансформаций.

Вѳедение гидроксильной группы. Микробиологическое гндроксилирование — это наиболее оажный н часто примениемыЙ метод. Наличие гидроксильных групп в 3, II, 16, 17 положениях молекулы стероида, как правило, обусловливает физиологиче-скую активность большинства гормоналыіых стероидных пре-паратов.

Гидроксилнрованне стероидов осуществляется очень многими микроорганизмами, чаще всего грибами, даже конидии некото-рых грибов обладамт гидроксилирующей активностью. Гидроксилирование стероидов ири помощи гриба Rh. nigricans — яркий пример сочетания, специфичности н разнообраэия действия микроорганиэмов.

lla-Гидроксилирование как один из важнейшнх путей получения кортизона изучено наиболее детально и давно применяется в иромышленноети, выходы продуктов трансформации очень высоки, Многие микроорганизмы образуют смесь 11а- и ПрѴ энантомеров, соотношение которых существенно зависйт от фазы развития культуры, как было показано в случае гидроксилирования вещества S Рейхштейна грибом Tieghemella orchidis. j

Ра;іработан метод получения гидрокортизона культурой Г. orchidis из вещества S Рейхштейна в условиях глубиняого культивирования. Наиболыией трансформирующей способноатью обладает 17-часоваи культура, за 10 ч она трансформируе 70% вещестна S Рейхштейна, выход гидрокортизона при составлнет 52%.

Наличие в молекуле стероидов IІр-гидрокетильноЙ, группы обусловливает физиологичсскую активность гидрокортиііна (кортизапа) и преднизолона. Гидрокснлированию подвергакггся субстраты самого различного строения— от производных эетра-на до сложных молекул стеринов, сапогеиннов и т, п. Причина этого - очень широкая субстратная снецифичность гидрокснДаз, которую демонстрируют миогие микроорганизмы. Так опи<|ан іитамм Cunninghamelta btakesteeana, который вводит оксигруііпу в I Ір-положение обшнрного пабора стероидов - различных производных чстрана, теетостерона, кортексолона, прогестерона и т. д.

Получение І4а-гилроксинрогестеронл при помощи Bacitlus cereus является одним из немногих примеров гидрокснлнровання при помоіди бактерий. І5а-Гидроксилированне осуществляется также многими микроорганизмами, основное место среди кото-рых занимают Fusarium и РепісШіит.

Главным препятствием, стоящим на гтути дальнейшего раз-ннтия ііромышленноіо микробнологического гидроксилирования стероидов, так жс как и вообще мнкробиологическнх трансфор-маднй этнх соединений, являетси низкая производительность ферментаиий, иесмотря на высокий продентный выход по суб-страту. Это обусловлено. с одной стороны, нерастворимостью стероидных субстратов в воде. с другой — токсичностью раство-рителей, применяемых при внесении стероида и невозможно-стью использовання высоких концентраций субстрата.

Дегидрогетаацин стероидов. Наличие двойиых связей корен-ным пбразом влияст на физиачогическую активность препаратов. Используя эту реакцию. получают такис эффсктнвные прсна-раты, как преднизолон. Чаще всего микроорганизмы дегидри-руют паіожения 1,2 и 4,5, но описано н введение двойной связи в положения 7,8; 8,9; 9.11; 16,17; 17,20. Реакции дегидрогени-зации осуществляют бактерии и актиномицсты, особенно часто это микоформы Arthrobacter, Corynebacterium, Nocartlia. Широ-кая субстратная специфичность дегидрогеназ показана на боль-шом эксперимеитальиом материале; она позволяет использовать в качестве субстратов ацетаты стероидов, которые являются полупродуктамн во многих технологических схемах получения стероидов. Напрнмер, Mycobacterium globiforme 193, дегидри-рующая 1,2-связь в кортизоне, так же эффсктивно превращает и кортизонацетат в преднизонацстат с выходом 86%. Исслсдо-вание показало, что для этой культуры характерна макснмальная удельная трансформирующан активность в период снижения уделыюй скорости роста.

Реакция дегидрогенизации позволяет получать преднизолон из корти.чона, дианабол и.ч метилтестостерона, преднизолон из гидрокорти.чона. Продукты 1,2-дегидрирования образуютси с пы-сокими выходами до 86%. Распространенность этой реакции объясняется ые только наличием соответствующих дегидрогеиаз у болыпого числа микроорганизмоп. но и химичсскими свой-ствами данного участка стсроидной молекулы, ее нсстабиль-ностью, особенно при наличии кетогруппы в 3-м положении и (или) двойной связи 4,5. Этими свойствами стероидной молекулы обънсняется и доступность связн 1,2 для микробиых оксидоре-дуктаз. Во многих случаях показака обратимость реакций дегидрогенизации и восстановления.

Микробиологическое восстаноѳление. Этот процесс использу-ется в меньшей степени, чем дегидрирование. Он осущесгвляется главным образом дрожжами и аназробнымн бактериямн, прел-ставителими микрофлоры кишечника млекопитающих, осущест-вляющими превратение холестерина в копростерин:

Описаны процессы насыщения двойных связей также и аэроб-ными культурами, широко известными как окислители — актино-мицетами, микоформамн и даже грибамн. ІІапример, культура Aspergillus fltivus восстанавливает ароматическое кольцо неко-торых стероидов:

Окисление гидроксильной группы в кетогруппу - одна из наиболее частых реакций, осуществляемых микроорганизмами (бактериими, актиномицетами, грибами). Наиболылий практиче-ский интерес представляют окислителыіые превращения гидро-ксильных групп у 3,17 и 20-го атомов стероидной молекулы. Окисление гидроксила в 3-м іюложении легко осуществляется у соедннений с ненасыщенным кольцом А, а также при наличии двойной связи в положении 4. К этому же типу окислителыіых превращсний относят введение кетогруппы в молекулу стероида.

 

78.Фитогормоны, классификация, характеристика. Индукторы митотического цикла.

Фитогормоны - низкомолекулярные органические вещества, вырабатываемые растениями и имеющие регуляторные функции. Используются в составе косметических препаратов, т.к. благодаря регуляторному действию позволяют эффективно воздействовать на состояние кожи, затормаживая старение, стимулируя рост и обновление клеток.

Бывают ситуации, когда растение в принципе здорово, но стрессовые факторы (пересадка/перевалка, транспортировка, ошибки в уходе) снижают его защитные силы и способность сопротивляться инфекциям.

Повысить жизнеспособность таких растений можно с помощью биостимуляторов - специальных препаратов, которые состоят из растительных экстрактов и содержат в различных пропорциях микроэлементы, аминокислоты, протеины (белки), кислоты жирного ряда, витамины, ферменты (энзимы) и вытяжки из компоста.

Здесь мы рассмотрим основные биостимуляторы, которые продаются в специализированных цветочных или садовых магазинах, а также некоторые теоретические материалы по этой теме.

Гормоны растений и классы фитогормонов

Эпин — регулятор роста растений Отечественный вариант японского природного биорегулятора и стимулятора эпибрассинолида JRDC-694, который содержится в клетках всех растений. Безопасное для человека и животных (КO – 4) и экологически безвредное средство, призванное помочь растениям, попавшим в сложные условия существования.

Циркон Биологический иммуностимулятор, корнеобразователь, индуктор цветения.

Гетероауксин (индолил-уксусная кислота) Препарат для стимулирования корнеобразования у черенков, рассады, луковиц цветов.

Силк Стимулятор роста и индуктор иммунитета растений.

Обязательными компонентами питательных сред должны быть фи-тогормоны. К ним относятся ауксины, регулирующие рост и дифферен-цировку клеток и цитокинины, индуцирующие клеточное деление. Природный ауксин в растении представлен в основном в виде |3-индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Для практических целей чаще применяют не ИУК, а синтетические ауксины (а-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), фенилук-сусная кислота (ФУК), фенилмасляная кислота (ФМК) и др.) В отличие от природных ауксинов эти соединения не разрушаются ИУК-оксида-зой в клетках растений.

В качестве источников цитокининов в средах используют кинетин, зеатин, 6-бензиламинопурин и др. Действие цитокининов проявляется прежде всего в ускорении клеточных делений, что опосредуется усилением синтеза ДНК, РНК, белков, а также в дифференцировке клеток. В состав некоторых сред входит ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают усвоение клетками железа.

 

79.Иммуносупрессоры. Циклоспорин А-ингибитор иммунного ответа кальций нейрина. Применение втрансплантологии. Новые иммуносупрессоры природного присхождения.

Среди иммунодепрессоров известны синтетические вещества (азатиоприн, меркаптопурин, преднизон, циклофосфамид и пр.), отдельные антибиотики (блеомицин, циклоспорин А,), а также зообиотехнологические продукты — антилимфоцитарный иммуноглобулин, aHTn-Rh0(D)Ig человека и лимфоцитарные кейлоны. Антилимфоцитарный IG получают из сыворотки крови животных по схеме, близкой к выделению IgG. При этом иммунизирующим агентом (антигеном) являются чело-веческие лейкоциты.

При выделении суммарных иммуноглобулинов можно использовать два подхода. Одии из них базируется на высаливании Ід-ов иасыіценным раствором аммония сульфата (3,9 М при 0°С или 4,06 М при 20вС) с последуіощей хроматографией раствореішого осадка антилимфоцитарного Ід в подходяіцем буфере (например, фосфат-ном — 0,01 М с рН 6,5). Хроматографию проводят на ионообмен-никах — ДЭАЭ-сефадексе или ДЭАЭ-целлюлозе.

Поскольку антилимфоцитарный Ід содержит разные Ig-ы со сходными характеристиками, то их можно разделить, измёняя ионную силу элюента.

В производственных условиях получают в среднем 5,5—6,0 г lgG из I л иммунной сыворотки в пересчете на сухое вещество. Более высокого выхода Ід удается достигнуть согласно другому методу — с помощью 2-этокси-6,9-диаминоакридинлактата, или риваиола (Дж. Хорейси, 1952). Выход IgG при этом составляет в среднем 60—65%.

Реакция взаимодействия риванола(катион) с белками протекает при незначительиом сдвиге рН от изоэлектрической точки, то есть при малом отрицательном заряде белковой молекулы, а образую-щийся риванольно-белковый комнлекс слабо растворим в воде — он растворим при рН 5,0.

В слабо щелочной среде риванол не обраэует комплексов с IgG, иа чем и основана очистка IgG:

IgG можно выделять прямо из иммунной сыворотки, добавляя к ней 0,75% раствор риванола в соотношении примерно 1:2.

 

80.Выделение, концентрирование и очистка биотехнологических продуктов. Сорбционная, ионообменная, аффинная хроматография применительно к выделению ферментов. Методы мембранного разделения.

На стадии выделения продукта главная задача — отделить основную часть продукта, пусть даже и с некоторыми примесями. Получается как бы неочищенный продукт. Поэтому, когда необходимо получать биопродукты высокой кондиции, добавляют еще стадию очистки продукта. Задача этой стадии — убрать примеси и сделать продукт максимально чистым.

Эта задача решается с помощью разнообразных процессов, в которых многие из тех, что уже были рассмотрены ранее (экстракция и экстрагирование, адсорбция, ионный обмен, ультрафильтрация и обратный осмос, ректификация и ферментолнз). Кроме этих процессов используют и следующие.

Хроматография — процесс, напоминающий адсорбцию. На твердом сорбенте собираются растворенные вещества, но не одно, а несколько, часто близких по структуре. Например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков. При адсорбции они и абсорбируются вместе. А вот при хроматографии они выходят из сорбента как бы по очереди, что и позволяет их разделять и, значит, очищать друг от друга.

Диализ — процесс, в котором через полупроницаемую перегородку могут проходить низкомолекулярные вещества, а высокомолекулярные остаются. Путем диализа осуществляют очистку вакцин и ферментов от солей и низкомолекулярных растворимых примесей.