Методы биофизики

 

Биофизические методы позволяют исследовать состояние и сложные процессы как целостного организма, так и его тканей, клеток, внутриклеточных структур и отдельных молекул.

Задачи методов биофизики

В настоящее время огромные успехи достигнуты в молекулярной биофизике, изучающей строение и физико-химические свойства биологически функциональных молекул, прежде всего биополимеров.

Теоретический аппарат молекулярной биофизики, основанный на равновесной термодинамике, статистической механике, квантовой механике, обуславливает использование широкого арсенала группы физических методов, используемых физиками для исследования макромолекул и их молекулярных масс, размеров и конфигурации. Другая группа физических методов основана на взаимодействии вещества и лучистой энергии, и использует лучистую энергию в диапазоне от рентгеновского до радиочастотного спектра излучений.

В биофизике используют основные физические методы, адапти-рованные к биологическим объектам

Оптические и спектроскопические методы включают рентгеноструктурный анализ, гамма-резонансную спектроскопию, электронные и колебательные спектры. К этой группе относятся методы поглощения и люминесценции в ультрафиолетовой и видимой частях спектра, инфракрасные спектры и спектры комбинационного рассеяния, спектрополярометрия, спектры ЯМР и ЭПР.

 

Для изучения превращений макромолекул используют также калориметрические методы, а для прямого изучения структуры белков и нуклеиновых кислот применяют электронную микроскопию.

В биофизике клетки широко используют уже названные выше методы, а также электрохимические методы, а также ряд других. Рассмотрим кратко некоторые из них.

Рентгеноструктурный анализ используется для получения информации о расположении атомов в молекулах и кристаллах. Метод основан на способности электронных оболочек атомов и молекул рассеивать электромагнитные волны рентгеновского диапазона. Интерференция волн, рассеянных веществом, приводит к возникновению дифракционной картины и анализ дифракционных максимумов позволяет определить распределение электронной плотности (модули и фазы), установить структуру объекта.

Методы ядерной физики основаны на использовании пучков элементарных частиц (электроны, протоны, нейтроны и т.д.). Синхронное излучение обеспечивает большие возможности рентгеновской спектроскопии. Энергия фотонов излучения достаточна для ионизации внутренних электронов в атомах. На краю поглощения рентгеновских лучей наблюдается тонкая структура полосы поглощения. Эта структура является результатом отражения сферической волны, испускаемой первичным поглотителем, от окружающих атомов и интерференции с рассеянными ими волнами.

Нейтронография находит также разнообразное применение. Пучок нейтронов подвергается монохроматизации отражением от кристаллической пластинки. Дифрагирующие нейтроны регистрируются счетчиками. Нейтроны рассеиваются ядром атома, а не его электронной оболочкой. Атомный фактор рассеяния определяется протоно-нейтронной структурой ядра, а не его атомным номером. Поэтому в отличие от рентгенографии, нейтронография позволяет надежно локализовать атомы водорода.

Г амма-резонансная спектроскопия является специфическим методом. Она основана на эффекте Мессбауэра, который заключается в резонансном поглощении атомным ядром монохроматического гамма-излучения, испускаемого радиоактивным атомом. Например, наличие в природных соединениях железа изотопа ⁵⁵Fe дает возможность изучать железосодержащие белки (гемоглобин, миоглобин, цитохромы и др.).

Электронные спектры поглощения. Оптические и спектроскопические свойства молекул определяются расстояниями между энергетическими уровнями молекулы и вероятностями перехода между ними. Их изучение обеспечивает получение информации о строении молекул. В ультрафиолетовой области спектра взаимодействуют молекулы белков и нуклеиновых кислот в результате того, что полипептидные и полинуклеотидные цепи имеют спектры поглощения в ультрафиолете. Изучение электронных спектров простых амидов показало, что электронные переходы осуществляются в амидной группе. В молекулярных кристаллах, вероятно, в регулярной совокупности тождественных хромофорных групп между их возбужденными энергетическими уровнями возможна резонансная передача энергии возбуждения в виде волны возбуждения - экситона.

Методы, основанные на люминесценции (флуоресценции), позволяют исследовать миграцию энергии в биологических процессах. Изучение поляризованной люминесценции дает представление о конформационной структуре и ее динамике, подвижности макромолекулы, ее отдельных групп.

Методы, использующие магнитную оптическую активность, нашли важное применение в молекулярной биофизике. Явление парамагнитного резонанса было открыто советским физиком Е.К. Завойским и легло в основу спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), широко используемого для изучения парамагнитных частиц и кинетики процессов с их участием. Примерами парамагнитных частиц являются свободные радикалы - частицы, содержащие неспаренные электроны, образующиеся в процессе биохимических превращений, в результате повреждений живых образований в следствие радиационного облучения, в ходе фотохимического окисления хлорофилла. Парамагнетические свойства таких металлов, как Fe, Co, Ni, Cu, Mn обусловлены особенностями заполнения электронных оболочек, когда на некоторых орбиталях локализованы неспаренные электроны.

ЭПР (электронный парамагнитный резонанс) в биологии используется для анализа парамагнитных частиц, для исследования триплетных состояний в ходе фотобиологических реакций, для исследования мембран или макромолекул.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) сходен с принципами ЭПР, но отличия ЯМР вызвано наличием магнитных моментов у ядер некоторых элементов. Магнитный момент ядра связан с собственным моментом количества движения ядра. Магнитным моментом обладают ядра, у которых спин не равен нулю. Если такое ядро поместить в магнитное поле, то магнитный момент ядра ориентируется параллельно или антипараллельно приложенному магнитному полю и при воздействии на систему ядер излучения с определенной частотой это излучение будет поглощаться при условии, что энергия кванта совпадает с разностью энергий взаимодействия ядра и приложенного магнитного поля.

Метод ЯМР в биологии применяют для изучения различных белков, наблюдения за их структурными изменениями, сопровождающими функционирование белков. Метод широко используют для изучение состояния воды в различных биологических объектах и при разнообразных состояниях. Наиболее часто в биологических исследованиях используют протонный резонанс, однако интересные результаты получены при использовании ¹³С и ³¹Р при изучении крупных белковых молекул и структуры мембран.

Группа электрических и электрохимических методов используется для изучения ионной проницаемости мембран и электрогенеза биопотенциалов. Прежде всего следует отметить, что эти методы позволяют получать информацию об объекте не изменяя его физиологического состояния, во-вторых, обеспечивают воспроизводимость результатов, в-третьих, автоматическую регистрацию.

Для изучения биоэлектрических явлений в живых системах, в том числе мембранных и распространяющихся потенциалов, используют усилители постоянного тока с высоким входным сопротивлением (электрометры) и малым дрейфом нуля и для их регистрации различные шлейфные осциллографы или иные самописцы. Отведение потенциала требует использования неполяризующихся электродов. Усовершенствование микроэлектродной техники привело к созданию селективных микроэлектродов, позволяющих измерять активность ионов калия, натрия, кальция, хлора и других в живой клетке и отдельных органеллах. Кончик микропипетки такого электрода заполнен жидким ионообменником или раствором нейтрального переносчика.

Другая группа методов изучения структуры и функциональной активности мембран основана на использовании переменного тока в широком диапазоне радиочастот для зондирования состояния клеточных структур на основе частотной дисперсии проводимости. Информацию можно получить на основании анализа взаимодействия тока на определенных частотах с объектом и его отдельными структурами по дисперсии величин активного и реактивного сопротивлений, сдвигу фазы, изменению диэлектрической проницаемости и др. С помощью пассивных электрических характеристик, величина которых зависит от функционального состояния биологического объекта, становится возможным определять изменения функциональной активности живого объекта в целом и отдельных его структур, например внутриклеточных образований, в зависимости от условий внешней среды или действия отдельных его факторов.

Математическое моделирование биологических систем позволяет математическими методами изучать свойства и моделировать биологические системы. Выбор математического аппарата для модели определяется не только экспериментальными условиями и свойствами системы, но и наличием математических аналогов, которые можно использовать при рассмотрении конкретных свойств биологического объекта. Принцип построения модели заключается в том, что на основании экспериментальных данных выбирается базовая модель. Далее параметры модели сопоставляются с экспериментальными данным и осуществляют верификацию, т.е. проверку модели на независимых экспериментальных данных.