Окраски мазков

Реактивы для окраски мазков по Нохту. 1. Основной раствор азура II: 1 г краски растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Оставляют в посуде из темного стекла на 12—14 дней при комнатной температуре, после чего используют. 2. Основной раствор эозина калия: 1 г краски растворяют в 1000 мл дистил­лированной воды. Оставляют в посуде из тем­ного стекла при комнатной температуре на 12— 14 дней, затем используют. 3. Фосфатный буфер (смесь Вейзе) рН 7,4—7,5: смешивают 0,49 г ка­лия фосфата однозамещенного безводного (КН₂Р0₄) и 0,909 г натрия фосфата двузамещенного безводного (Na₂HPO,t) и дистиллиро­ванной воды 1000 мл. 4. Рабочий раствор азур-эозина: перед употреблением смешивают 25 мл основного раствора азура II, 20 мл основного раствора эозина калия и 55 мл буферного раст­вора (пропорции красителей могут варьировать, их устанавливают опытным путем при приготов­лении свежих партий основных растворов).

Реактивы для окраски мазков по Паппенгейму. 1. Раствор эозин-метиленового синего по Маю — Грюнвальду. При от­сутствии готового раствора красителя его можно приготовить, растворив 1 г сухого красителя в 1000 мл метилового спирта. Раствор готов к употреблению через 4 дня. 2. Рабочий раствор азур-эозина по Нохту.

Специальное оборудование. Кювета для фиксации и окраски мазков со шта­тивом-контейнером (при отсутствии используют эмалированные лотки с установленными для стекол «рельсами» из пары стеклянных палочек, соединенных резиновыми трубками).

Фиксация мазков. Фиксатор мазков наливают либо в кювету, либо в широкогорлую посуду с притертой пробкой. Высушенные на воздухе мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с фиксатором (или кладут по одному в посуду) на 5—10 мин. Вынимают кон­тейнер со стеклами из кюветы (или вынимают пинцетом стекла и устанавливают в штативе), оставляют на воздухе до полного высыхания.

 

Окраска по Нохту.

Высохшие фикси­рованные мазки, не вынимая из контейнера, по­мещают в кювету с рабочим раствором краски на строго определенное время, подобранное для каждой партии красителя (от 20 до 45 мин). При отсутствии кюветы с контейнером стекла поме­щают горизонтально на «рельсы» (мазком квер­ху) и наливают высокий слой (3—4 мл на мазок) рабочего раствора краски. Вынимают контейнер со стеклами из кюветы с красителем и поме­щают его в кювету с водопроводной водой (при отсутствии кюветы краску со стекол смывают, не снимая их с «рельсов», водопроводной водой). Высушивают мазки на воздухе.

 

Окраска по Романовскому — Г и м з е

Производится так же, как и по Нохту: в качестве красителя используют готовый раст­вор Романовского—Гимзы, который перед упот­реблением разводят из расчета 1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды(1:10). Время окраски устанавливают опытным путем для каждой но­вой партии красителя (25—40 мин) = 30 мин

 

Комбинированная окраска Мая—Грюнвальда—Романов­ского—Гимзе по Паппенгему.

 

На нефиксированный мазок налива­ют пипеткой готовый краситель — фиксатор Мая—Грюнвальда, представляющий собой раствор эозин-метиленового синего в метиленовом спирте, на 3 мин. Через 3 мин к покрывающей раст­вор краске добавляют равное количество дистиллированной во­ды и продолжают окрашивание еще 1 мин. После этого краску смывают и мазок высушивают на воздухе. Затем высушенный мазок докрашивают свежеприготовленным водным раствором краски Романовского в течение 8—15 мин.(=10 мин).

 

2.9.Лейкоцитарная формула

 

 

2.9.1 Методика подсчета лейкоцитарной формулы

Количество лейкоцитов в сосудистом русле зависит от выраженности процессов их образования, скорости их выхода (мобилизации) из костного мозга и перемещения в ткани (в особенно­сти в очаги повреждения), от степени захвата легкими и селезенкой. В силу этих и других причин содержание лейкоцитов в крови здорового человека подвержено определенным коле­баниям: оно повышается к концу дня, при физической нагрузке, эмоциональном напряжении, резкой смене темпера­туры окружающей среды. Следует иметь в виду и возмож­ность перераспределения лейкоцитов в кровяном русле за счет их пристеночного накопления в сосудах с замедленным кровотоком. Увеличение их содержания наступает после при­ема пищи (пищеварительный лейкоцитоз). Даже положение руки в момент взятия крови из пальца может повлиять на ре­зультаты анализа.

Самый многочисленный отряд лейкоцитов составляют гранулоциты, т.е. зернистые лейкоциты. Зернистыми они называются потому, что в их цитоплазме обнаруживается мно­жество мелких зернышек. К зернистым лейкоцитам относят эозинофилы, т.е. лейкоциты, окрашивающиеся кислыми красителями (у здорового человека на их долю приходится (1 —5% от всего количества лейкоцитов), базофилы, окрашивающие­ся основными красками (в норме их не более 1% от всего ко­личества лейкоцитов), а также нейтрофилы, окрашивающие­ся нейтральными красителями и составляющие большинство лейкоцитов. Последние различаются по степени своей зрелости и делятся на юные лейкоциты (0-1%), лейкоциты среднего возраста — палочкоядерные (1-6 %) и зрелые, или сегментоядерные, нейтрофилы (47—72%).

Эозинофилы и базофилы служат «транспортерами» важ­ного биогенного амина — гистамина, избыток которого вызы­вает аллергические реакции, проявляющиеся, в частности, в виде крапивницы и бронхиальной астмы.

Другая разновидность лейкоцитов — агранулоциты, т.е. лейкоциты, лишенные мелких зернышек, гранул. К ним от­носятся моноциты, которые могут образовываться не только в костном мозге, но и в лимфатических узлах, элементах со­единительной ткани. К агранулоцитам причисляют также лимфоциты, образующиеся преимущественно в лимфатичес­ких узлах. У практически здорового человека моноциты со­ставляют 3—9%, лимфоциты — 19-37 от всего количества лейкоцитов.

При резкой активации кроветворения возможен выход я кровь незрелых лейкоцитарных клеток (вплоть до бластных).

Лейкоцитарная формула -это процентное соотношение различных видов лейкоцитов.В норме встречаются: нейтрофилы - палочкоядерные- 1-6 %. сегм.- 47-72 и т. Д

При патологических процессах в крови могут выявлять и предшественники палочкоядерных клеток: метамиелоцит. и миелобласты.

Увеличение содержания нейтрофилов в крови характер, но для острых инфекционных заболеваний, интоксикация злокачественных новообразований, т.е. всех тех состоят которым свойственно внедрение в организм микробов, накопление в нем продуктов распада клеток, чужеродных веществ (известно, что нейтрофилы выполняют в организм фагоцитарную и бактерицидную функции). Оно особенно выражено при лейкозах. В крови больных лейкозами и страдающих так называемыми лейкемоидными реакциями обнаруживаются и предшественники обычных лейкоцитов — миелоциты, промиелоциты и миелобласты.

Появление незрелых нейтрофилов в крови (большого количества палочкоядерных нейтрофилов, метамиелоцитов юных миелоцитов, промиелоцитов) носит название нейтрофильного сдвига влево. Его выраженность отражает тяжесть патологического процесса. При многих тяжелых инфекциях септических и гнойных процессах лейкоцитарная формула изменяется за счет увеличения количества палочкоядерных нейтрофилов, метамиелоцитов и миелоцитов. Такой ядерный сдвиг влево встречается, в частности, при ангинах, остром ап­пендиците, холецистите, тяжелых формах пневмоний, актив ном туберкулезе, абсцессе легкого, гнойном менингите, дифтерии, сепсисе.

Значительное количество нейтрофилов с повышенной сегментированностью ядер характеризует нейтрофильный сдвиг вправо. Он наблюдается при лучевой болезни, некоторых других заболеваниях.

Для дополнительной, углубленной оценки сдвига в лейкоцитарной формуле (влево, вправо) нередко прибегают к рас­чету индекса сдвига (ИС) в содержании нейтрофилов, различающихся структурой ядра. Под индексом сдвига принято понимать соотношение показателей: (миелоциты+метамиелоциты+палочкоядерные нейтрофилы)/сегментоядерные нейтрофилы. В норме ИС составляет 0,06.

При лейкопенических реакциях уменьшается количеств нейтрофилов в крови. Такое наблюдается при гипо- и апластической анемии, лучевой болезни. Для этих состояний характерно угнетение продукции клеток костным мозгом, сис­тематическом употреблении некоторых лекарственных пре­паратов: сульфаниламидов, амидопирина, снотворных и др.

Изменения содержания отдельных

элементов белой крови

1.Базофилы. Увеличение числа базофилов встречается при хроничес­ком миелолейкозе, полицитемии, гемофилии, гемолитических анемиях, гипотиреозе, при введении сывороток. Уменьшение чиста базофилов ма­ло известно, так как малое нормальное содержание (0,4%) затрудняет изучение таких состояний.

 

2.Эозинофилы. Увеличение — эозинофилия — содержания эозинофилов в крови свыше 5—6%. Эозинофилия связана с антигистаминной, антиток­сической и фагоцитарными функциями эозинофилов. Эозинофилия встре­чается, как правило, при различных аллергических заболеваниях и синдро­мах: бронхиальной астме, крапивнице, отеке Квинке и др. В основе эозинофилии при заболеваниях лежит всасывание эозинофилами специфических аллергенов гистаминовой природы. Умеренная эозинофилия может наблю­даться при выздоровлении от инфекционных и воспалительных заболева­ний («заря выздоровления»). Повышение эозинофилов до 10—35% наблю­дается при пенициллинотерапии. Описывают случаи аутоимунной эозинофилии, достигающей иногда 60—70%, природа которых остается неизвест­ной. Эозинофилия наблюдается также при следующих болезнях крови: лимфогранулематозе и хроническом миелолейкозе (увеличение абсолютно­го количества эозинофилов при нормальном процентном соотношении — базофильно-эозинофильная ассоциация). Уменьшение — эозинопения или анэозинофилия — встречается при: острых инфекционных заболеваниях в разгаре болезни, при различных стрессовых ситуациях (инфаркт миокар­да), синдроме Кушинга, при острых лейкозах (базофильно-эозинофильная диссоциация), В_|2-фолиево-дефицитной анемии (до лечения).

3. Нейтрофилы. Увеличение — нейтрофилез — появляется при инфек­ционных или гнойно-воспалительных процессах, лейкозах (хроническом миелолейкозе и миелозе), лейкемоидных реакциях. При этом обычно воз­никает ядерный сдвиг нейтрофилов влево, т.е. повышается число незре­лых нейтрофилов — палочкоядерных форм, юных и даже миелоцитов в пе­риферической крови (незрелые нейтрофилы ставят в лейкоцитарной фор­муле слева). Обычно это сочетается с увеличением общего содержания лейкоцитов в крови и называется регенеративным сдвигом влево. Извес­тен и сдвиг вправо — уменьшение количества палочкоядерных нейтрофи­лов и повышение содержания гиперсегментированных форм (при В₁₂-фо-лиево-дефицитной анемии). Уменьшение количества нейтрофилов — нейтропения — обычно сочетается с уменьшением количества лейкоцитов и наблюдается при функциональном или органическом угнетении гранулоцитопоэза. Нейтропения встречается при вирусных инфекциях, брюш­ном тифе, бруцеллезе, малярии, тяжелом сепсисе, В_|2-фолиево-дефицитной анемии, лекарственных лейкопениях, алейкилиях (апластическая анемия). В противоположность указанному регенеративному ядерному сдвигу нейтрофилов влево существует и дегенеративный сдвиг нейтрофилов влево. Он заключается в том, что увеличивается количество только палочкоядерных форм нейтрофилов (без юных), которые дегенеративные изменения (вакуолизация цитоплазмы, пикноз). При этом имеет место нейтропения и отсутствует лейкоцитоз. Дегенеративный сдвиг влево возникает при угнетении костного мозга (тиф, туберкулез) и свидетельствует о снижении защитных сил организма.

4Лимфоциты. Увеличение — относительный лимфоцитоз при всех лейкопениях, зависящих от нейтропении (брюшной тиф, грипп); абсолютный лимфоцитоз — часто наблюдается в период выздоровления от инфекционных заболеваний, а также при доброкачественном течении туберкулеза, сифилиса, коклюше, лимфолейкозах. Уменьшение — относительная лимфопения — при нейтрофильном лейкоцитозе (круг пневмония, инфаркт миокарда), миелолейкозе; абсолютная лимфопения встречается редко (лучевая болезнь).

5.Моноциты. Увеличение — относительный моноцитоз — возникает в тех же случаях, что и относительный лимфоцитоз (при нейтропениях); абсолютный моноцитоз возникает в период выздоровления от острых инфекционных заболеваний, при гельминтозах, хронической инфекции - туберкулезе, сифилисе, инфекционном мононуклеозе. Уменьшение моноцитопения — возникает при тяжелом сепсисе, относительная миело - и лимфолейкозах.

Изменения в клеточном составе «белой» крови могут быть классифицированы на 5 основных типов.

Нейтрофильно-эозинопенический. Характеризуется увеличением содержания лейкоцитов, нейтрофилов; снижением эозинофилов, лимфоцитов, моноцитов. Наблюдается при онкологических заболеваниях (раке), пневмониях, перитоните, септических инфекциях.

Нейтрофильно-эозинофильный. Выявляются лейкоцитоз, нейтрофильный сдвиг влево, уменьшение содержания лимфоцитов (лимфопения), моноцитов (моноцитопения) повышенное содержание эозинофилов. Встречается при туберкулезе легких, лимфогранулематозе, скарлатине.

Нейтропенический. Характеризуется уменьшением с держания лейкоцитов и нейтрофилов, «дегенеративным сдвигом влево, относительным лимфоцитозом. Отмечается при инфекционных заболеваниях (брюшном тифе, кори, бруцеллезе, гриппе и др.).

Лимфатические и моноцитарные реакции: лейкоцитоз лимфоцитоз, моноцитоз. Встречается при инфекционных заболеваниях.

Протозойный. Сопровождается лейкопенией, нейтропенией (с нейтральным сдвигом влево), лимфопенией. Чаш наблюдается при малярии, лейшманиозе.

При осложненном течении гнойно-воспалительных про­весов весьма показательно изменение лейкоцитарного ин­декса интоксикации (ЛИИ), рассчитываемого по формуле:

(4Ми + ЗЮ + 2П + С)х (Пл. + 1)

ЛИИ =

(Мон + Лимф) х (Э + 1),

где Ми — миелоциты, Ю. — юные, П. — палочкоядерные, С - сегментоядерные нейтрофилы; Пл. — плазматические клетки; Мон — моноциты; Лимф — лимфоциты; Э — эозинофилы.

Лейкоцитарная формула здорового человека

Лейкоциты	Базофилы	Эозинофилы	Юные нейтрофилы	Палочкоядерные нейтрофилы	Сегментоядерные нейтрофилы	Лимфоциты	Моно­циты
4,0- 9,0х 109/л	0-1%	0,5-5 %	0-1%	1-6%	47-72%	19-37%	3-9%

Принцип: Микроскопия сухих фиксированных и окрашенных мазков крови с дифференцированием различных форм лейкоцитов.

Реактивы: 1.Иммерсионное масло

2.70% спирт

Специальное оборудование:

1.Микроскоп

2.11- Клавишный счетчик для подсчета лейкоцитарной формулы или счетные машинки СЛ-1

 

Ход исследования

Подсчет лейкоцитарной формулы проводят с помощью иммерсионной системы микроскопа. В связи с тем, что мазке различные виды лейкоцитов располагаются неравномерно (моноциты и нейтрофилы — преимущественно вдоль верхнего и нижнего продольного края препарата, лимфоциты — ближе к его центру), подсчет лейкоцитарной формулы осуществляют, пользуясь следующими методическими указаниями. Под малым увеличением микроскопа находят край мазка крови вблизи образовавшей щеточки. У продольного края мазка наносят каплю иммерсионного масла, после чего фокусируют плоскость препарата. Наблюдая в окуляр, отступают на 2—3 поля зрения по направлению к середине мазка. Затем продолжают продвижение препарата в том же направлении на 3—5 полей зрения, в каждом из них подсчитывая имеющиеся лейкоциты. Вслед за этим продвигают мазок 3—5 полей зрения вдоль продольного края, меняя правление продвижения мазка под прямым углом, возвращаются к краю мазка, продвигая при этом мазок еще 3—5 полей зрения и так далее. Зигзагообразную линию, по которой продвигают мазок крови, называют линией Меандра:

 

Подсчет продолжают до тех пор, пока не будет сосчитано 50 % клеток. Затем подсчет продолжают на противоположной стороне мазка, т. е 50 лейкоцитов вверху и 50 лейкоцитов внизу. Так же, как описано выше, при про­тяжении мазка подсчитывают все лейкоциты, обнаруживаемые в поле зрения. Подсчет заканчивают, когда сумма лейкоцитов будет равна 100. Регистрацию лейкоцитов при подсчете производят с помощью счетчика II клавишного СЛ-1, при этом получают общую сумму и количество каждого вида лейкоцитов в процентах. При отсутствии счетчика регистрацию производят с помощью записи на листе бумаги. По вертикали записывают начальные буквы названий лейкоцитов: метамиелоциты (мтмц.), палочкоядерные (п.), сегментоядерные (с.), эозинофильные (э.), базофильные гранулоциты (б.), лимфоциты (лимф.), моноциты (мон.), плазматические клетки (мл.). По мере подсчета лейкоцитарной формулы каждый найденный лейкоцит регистрируют палочкой или точкой, которую ставят в горизонтальном ряду, соответствующем тому или иному виду лейкоцитов. Для облегчения последующего подсчета каждого вида лейкоцитов палочки или точки группируются десятками:

 

Процентное содержание различных видов лейкоцитов не отражает истинного количества их в 1 л крови, поэтому вычисляют абсолютное содержание лейкоцитов в 1 л крови.. Для этого необходимо знать количество лейкоцитов в I л крови, процентное содержание отдельных их видов, подсчитанных в окрашенном препарате. Абсолютное содержание отдельных видов лейкоцитов в 1 л крови высчитывают, пользуясь следующей пропорцией: а — 100 %, х-б, где а — количество лейкоцитов, подсчитанных в камереГоряева; б — процентное содержание лейкоцитов подсчитанных в мазке крови. Допустим, что количество лейкоцитов, подсчитанных в камере Горяева, составляет 8х 10⁹/л, а количество моноцитов, посчитанных в мазке крови, — 4%. Абсолютное количество моноцитов будет равно:

 

8х 10⁹/л-100 %

8х 10⁹/л х 4 = 0,32 х10⁹/л экземпляров

Х - 4%, х= 100

 

 

Морфологические структурные изменения лейкоцитов

при патологии

 

Структурные изменения в лейкоцитах (токсикогенная зернистость, вакуолизация, пикноз; хроматинолиз, кариорексис, цитолиз) выявляют в окрашенных препаратах крови; некоторые из них могут быть выявлены только в цитоплазме или только в ядре клеток; нередки сочетания различный структурных изменений в лейкоцитах.

Включения Князькова — Деле — крупные голубого цвета комочки, имеющие различную форму и находящиеся в цитоплазму нейтрофильных гранулоцитов.

Тельца Амато — образования округлой формы или в виде запятой, бледно-голубого цвета, содержащие красные или красно-фиолетовые гранулы.

Истощение зернистости проявляется либо уменьшением, либо ее полным исчезновением, что наиболее часто наблюдают в цитоплазме нейтрофильных гранулоцитов, исходящих из воспалительного очага костногоо мозга при его токсическом поражении, леченном хроническом миелоидном лейкозе.

Несоответствие степени созреванияядра и цитоплазмы — может быть выявлено «молодое» ядро в созревшей цитоплазме и, наоборот, зрелое ядро и базофильная цитоплазма в нейтрофильных гранулоцитах, что наблюдают, например, при хроническом миелоидном лейкозе.

Вакуолизация цитоплазмы и ядра в виде небольшого размера бесцветных пятен, количество которых варьирует от единичных до множественных и часто округленных (в нейтрофильных гранулоцитах) гранул.

Пикноз ядра выявляется в виде уплотненного, интенсивно окрашенного базихроматина; ядро или участок ядра уменьшается в размере, становится бесструктурным.

Гиперсегментация ядра — количество сегментов в ядре клетки варьирует от 6 до 10 и более. Помимо мегалобластных анемий, гиперсегментацию выявляют после воздействия химических веществ, проникающего ионизирующего излучения.

Фрагментоз — от участков основного ядра отделяются фрагменты, связанные с ним тонкой нитью базихроматина. Количество фрагментов варьирует от единичных до множественных.

Гипохроматоз — в связи с изменением физико-химической структуры хроматин не окрашивается, остается светлым; контуры ядерной оболочки не выявляются.

Хроматинолиз — в связи с раз­рушением хроматина весь массив ядра или его участок не окрашивается, остается светлым; контуры ядерной оболочки четкие.

Кариорексис —распад ядра на отдель­ные частицы, не связанные между собой; частицы имеют округлую форму, разную величину, большей частью плот­ные, интенсивно окрашенные (пикнотичные).

Кариолиз — разрушение ядра. Обычно на месте ядра или разрушен­ного его участка остается бесструктурное образование.

Анизоцитоз — появление небольших, крупных и гигант­ских клеточных элементов, что наиболее характерно для нейтрофильных гранулоцитов. Лейколиз — разрушение лейкоцита. Термин часто используют для описания раз­рушенных лимфоцитов при хроническом лимфоидном лейкозе.

Цитолиз — разрушение клетки с образо­ванием бесструктурной, бесформенной массы.

Перечисленные выше структурные изменения в лейкоцитах наблюдают при воспалительных (особенно септических) состояниях, некоторых инфекционных и паразитарных заболеваниях, лейкозах, анемиях и т.д.