Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза ДНК

Полимеразная цепная реакция является эффективным методом, который за короткое время стал одним из самых широко распространённых в молекулярной биологии, поскольку он быстрый, недорогой и простой. Этот метод позволяет амплифицировать специфические фрагменты ДНК из незначительных количеств материала, содержащего ДНК, даже тогда, когда этот источник ДНК имеет низкое качество [Щелкунов и др., 2004, С. 496].

Помимо амплификации (увеличения числа копий) ДНК, ПЦР позволяет производить много других манипуляций с нуклеиновымикислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственых условиях (invitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов [Глик и др., 2002, С. 589].

ПЦР проводят в ампификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °С.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

· Праймеры- короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

· Термостабильная ДНК-полимераза— фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов— Thermusaquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcusfuriosus (Pfu-полимераза), Pyrococcuswoesei (Pwo-полимераза) и другие.

· Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.

Ход реакции:

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий [Щелкунов С. Н., 2004, 496с.]:

Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии— 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Элонгация

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент ДНК. Через некоторое количество циклов рост количества продуктов замедляется за счет ограничения количества реагентов, наличия ингибиторов, появления побочных продуктов реакции.

В настоящем исследовании амплификацию полиморфных локусов rs2710102 и rs2530310 в гене контактин-ассоциированно-подобного белка-2 (CNTNAP2) проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе Т100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США).

Последовательности праймеров были следующие:

для rs2710102:

CNTNAP2 -27-D 5’- CTGGCTGGTACCTGCAAACT -3’,

CNTNAP2 -27-R 5’- ACACATGGATGGACTGACCG -3’;

для rs2530310:

CNTNAP2 -25-D 5’- CAGCACGCATTTACAAGTTTATTTC -3’,

CNTNAP2 -25-R 5’- ACAGCCATCTCCGAAAGCAG -3’;

Объем реакционной смеси составлял 15 мкл и включал в себя следующие обязательные компоненты: 10хTaq Буфер, pH 8.6 (300 mM Трис-HCl, pH 8.6/25 °C, 166 mM (NH4)₂SO₄, 25 mM MgCl2) («Cилекс», Россия), 250мкМ каждого dNTP, по 10 пмоль каждого из праймеров, 10-20 нг тотальной ДНК и 0,05 единицы Taq ДНК-полимеразы Thermus aquaticus («Cилекс», Россия). Режим амплификации включал в себя несколько стадий: предварительная денатурация (94⁰С, 4 мин.), 35 циклов амплификации: денатурация – 94⁰С, 30 сек.; отжиг праймеров – 58⁰С, 30 сек.; синтез (элонгация) – 72⁰С, 30 сек., завершающий синтез (72⁰С, 5 мин.).