МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ 4 страницаA.faecalis 415 - -6 при посеве из разведения: 10 - рост не менее чем в 2-х пробирках; -7 10 - рост не менее чем в 1 пробирке; -8 10 - рост не менее чем в 1 пробирке. С.novyi 198 - -3 при посеве из разведения: 10 - рост не менее чем в 2-х пробирках; -4 10 - рост не менее чем в 1 пробирке; -5 10 - рост не менее чем в 1 пробирке. При росте тест-штамма A.faecalis 415 в тиогликолевой среде отмечается помутнение верхней части столбика среды. При росте тест-штамма С.novyi 198 через 24 ч наблюдается образование отдельных шарообразных колоний, через 48 ч - диффузное помутнение среды с выраженной прозрачной зоной в верхней части столбика среды. Тиогликолевую среду признают годной по нейтрализующим свойствам, если не позднее 5 суток инкубации посевов визуально обнаруживается, в случае предварительного введения в среду мертиолята, выраженный рост тест-штамма A.faecalis 415 не менее -7 чем в 2-х из 3-х засеянных пробирок при посеве из разведения 10. Допускается признать пригодной по нейтрализующим свойствам среду при следующих результатах роста тест-штамма: А.faecalis 415 - -6 при посеве из разведения: 10 - рост не менее чем в 2-х пробирках; -7 10 - рост не менее чем в 1 пробирке; -8 10 - рост не менее чем в 1 пробирке. Описание характера роста тест-штамма A.faecalis 415 изложено выше. Тиогликолевая среда, не отвечающая по нейтрализующим свойствам необходимым требованиям (при полном соответствии качества среды по всем другим показателям), может быть использована для контроля стерильности препаратов, не содержащих ртутный консервант.
Приложение
1. Тиогликолевая среда
Состав: 1. Гидролизат казеина неглубокой степени расщепления ферментативный сухой - 15,0 г 2. Экстракт кормовых дрожжей для микробиологических питательных сред сухой (ЭКД) - 5,0 г 3. Натрия хлорид - 2,5 г 4. Глюкоза - 5,0 г 5. L-цистин - 0,75 г 6. Кислота тиогликолевая или - 0,3 мл натрия тиогликолят - 0,5 г 7. Агар микробиологический - 0,75 г 8. Вода дистиллированная - 1000 мл. pH 7,0 +/- 0,2 (после стерилизации среды) Приготовление В дистиллированную воду вносят гидролизат казеина, экстракт дрожжей, хлорид натрия, агар, размешивают и нагревают до температуры 60 - 70 °С. Цистин предварительно растворяют при постепенном добавлении 10%-ного раствора гидроксида натрия (до полного растворения). Раствор цистина вносят в приготовленную смесь, устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия, кипятят в течение 2 - 3 мин. до полного расплавления агара. Добавляют глюкозу и тиогликолевую кислоту, фильтруют через фильтровальную бумагу, устанавливают pH 7,2 - 7,3 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. Готовую среду хранят в защищенном от света месте при температуре 18 - 25 °С.
2. Бульон Хоттингера
Состав: г/л 1. Гидролизат Хоттингера - 20,0 2. Натрия хлорид - 5,0. Приготовление Гидролизат Хоттингера <*> смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 20 г сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л. -------------------------------- <*> Во всех питательных средах, имеющих в своем составе гидролизат Хоттингера, используется гидролизат, предварительно освобожденный от балластных белков, которые удаляют путем подкисления до pH 4,5 - 4,7 с помощью раствора соляной кислоты (соотношение с водой 1:1), последующего кипячения в течение 1 - 2 минут и фильтрации через ватно-марлевый фильтр.
Устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия, кипятят в течение 2 - 3 мин., фильтруют через фильтровальную бумагу, устанавливают pH 7,2 - 7,4 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 10 мл в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х месяцев со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.
3. Агар Хоттингера
Состав: г/л 1. Гидролизат Хоттингера - 20,0 2. Натрия хлорид - 5,0 3. Агар микробиологический - 13,0 - 20,0 <*>. -------------------------------- <*> Варьирование величины связано с различной прочностью студня агара.
Приготовление Гидролизат Хоттингера (Приложение, п. 2) смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 20 г сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л и агар. Устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия. Расплавление агара производят в автоклаве при температуре 100 °С в течение 1 ч, затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2 - 7,4 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х месяцев со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.
4. Среда Романова
Состав: г/л 1. Гидролизат казеина панкреатический - 8,0 2. Натрия хлорид - 5,0 3. Агар микробиологический - 5,0 - 10,0 <*>. -------------------------------- <*> Варьирование величины связано с различной прочностью студня агара.
Приготовление Панкреатический гидролизат казеина <*> смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 8,0 сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л, и агар, устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия. Расплавление агара производят в автоклаве при температуре 100 °С в течение 1 ч, затем среду фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2 - 7,4 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 5 мл в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. -------------------------------- <*> Используют панкреатический гидролизат казеина с содержанием общего азота 12,0 - 12,5% и аминного азота 5 - 7%, предварительно освобожденный от балластных белков по методу, изложенному для гидролизата Хоттингера (Приложение, п. 2).
Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х месяцев со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.
5. Среда Тароцци
Состав: г/л 1. Гидролизат Хоттингера - 25,0 2. Глюкоза - 5,0 3. Натрия хлорид - 5,0 4. Агар микробиологический - 1,0 5. Фарш мясной (на 1 пробирку с 10 мл среды) - 0,3 - 0,5.
Приготовление Гидролизат Хоттингера (Приложение, п. 2) смешивают с дистиллированной водой из расчета содержания в 1 л среды 25,0 г сухих веществ, вносят такое количество хлорида натрия, чтобы содержание его в среде составляло 5 г/л, и агар, устанавливают pH 8,0 - 8,2 с помощью 1%-ного раствора гидроксида натрия. Смесь кипятят до расплавления агара в течение 2 - 3 мин., фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют глюкозу и устанавливают pH 7,4 - 7,6 с помощью 5%-ного раствора соляной кислоты. Разливают по 10 мл в пробирки, содержащие мясной фарш, и стерилизуют автоклавированием при температуре 110 °С в течение 30 мин. Готовая среда годна к употреблению в течение месяца со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С. Приготовление фарша Мясной фарш заливают питьевой водой в соотношении 1:5 (по объему) и кипятят в течение 1 - 2 мин., затем сливают воду, фарш промывают водой и отжимают. Фарш заливают дистиллированной водой и повторяют операцию, используя дистиллированную воду, до получения полностью обезжиренного фарша. (В случае использования сырого фарша его предварительно кипятят в воде в течение 30 мин.) Отжатый с помощью ручного пресса и подсушенный на фильтровальной бумаге фарш закладывают в стерильные флаконы, стерилизуют автоклавированием при температуре 120 °С в течение 30 мин. и хранят при температуре 18 - 25 °С. По мере необходимости фарш раскладывают по стерильным пробиркам (из расчета 0,3 - 0,5 г на 10 мл среды), стерилизуют автоклавированием при температуре 120 °С в течение 30 мин. и выдерживают при температуре 37 - 45 °С до полного высыхания фарша. Следует иметь в виду, что при использовании недостаточно обезжиренного и высушенного фарша в среде может наблюдаться опалесценция.
6. Раствор для разведения культуры ("разводящая" жидкость)
Состав (на 1 л раствора): 1. Натрия хлорид - 8,5 г 2. Кислота тиогликолевая - 0,3 мл.
Приготовление Растворяют 8,5 г хлорида натрия в 1 л дистиллированной воды, добавляют 0,3 мл тиогликолевой кислоты, устанавливают pH 7,2 +/- 0,2 с помощью 10%-ного раствора фосфата натрия двузамещенного, разливают во флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. Разводящую жидкость можно использовать в течение недели со дня приготовления при соблюдении следующего условия: если срок хранения раствора превышает сутки со дня приготовления, его необходимо регенерировать перед посевом путем выдерживания флаконов в кипящей водяной бане в течение 10 - 15 мин. и последующего быстрого охлаждения в воде. Для удобства работы разводящую жидкость перед регенерацией рекомендуется, соблюдая правила асептики, разлить по 9 мл в стерильные пробирки, регенерировать ее в пробирках и затем использовать для разведения культуры.
7. Среда для получения спор
Состав: г/л 1. Гидролизат казеина неглубокой степени расщепления ферментативный сухой - 15,0 2. Глюкоза - 2,0 3. Натрия хлорид - 5,0 4. Агар микробиологический - 1,0 5. Казеин хлоркальциевый (на 1 пробирку с 10 мл среды) 0,3 - 0,5.
Приготовление Гидролизат казеина смешивают с дистиллированной водой, вносят хлорид натрия и агар. Устанавливают pH 7,9 - 8,1 с помощью 10%-ного раствора гидроксида натрия. Смесь кипятят до расплавления агара в течение 2 - 3 мин., фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют глюкозу. Разливают по 10 мл в пробирки, содержащие стерильный казеин <*>, и стерилизуют автоклавированием при температуре 121 °С в течение 15 мин. -------------------------------- <*> Стерилизацию казеина осуществляют в пробирках автоклавированием при температуре 120 °С в течение 30 мин.
Готовая среда годна к употреблению в течение 2-х мес. со дня приготовления при условии хранения ее при температуре 2 - 8 °С.
Таблица 4
ЖУРНАЛ УЧЕТА РЕЗУЛЬТАТОВ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ТИОГЛИКОЛЕВОЙ СРЕДЫ
┌─┬────────┬───────┬────────┬───────────────────────────────────────────────────────────┬────────────────────────────────────────────┬─────┬─────┬────┐ │N│ Дата │N │Дата │ Ростовые свойства │ Нейтрализующие свойства │Зак- │Под- │При-│ │ │контроля│серии │приго- ├─────────────────────────────┬─────────────────────────────┼────────────────────────────────────────────┤люче-│пись │ме- │ │п│ │среды, │товления│ A.faecalis 415 │ С.novyi 198 │ A.faecalis 415 │ние │отв. │ча- │ │/│ │конт- │среды ├──────────────┬──────────────┼──────────────┬──────────────┼──────────────┬──────────────┬──────────────┤о │за │ние │ │п│ │рольный│ │ 24 ч │ 48 ч │ 24 ч │ 48 ч │ 24 ч │ 48 ч │ 5 сут. │при- │конт-│ │ │ │ │номер │ ├──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┼──────────────┴──────────────┴──────────────┤год- │роль │ │ │ │ │ │ │ Разведение │ Разведение │ности│ │ │ │ │ │ │ ├──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┼──────────────┬──────────────┬──────────────┤среды│ │ │ │ │ │ │ │ -6 -7 -8│ -6 -7 -8│ -3 -4 -5│ -3 -4 -5│ -6 -7 -8│ -6 -7 -8│ -6 -7 -8│ │ │ │ │ │ │ │ │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │10 10 10 │ │ │ │ ├─┴────────┴───────┴────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴─────┴─────┴────┤ │ Пример │ ├─┬────────┬───────┬────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬──────────────┬─────┬─────┬────┤ │1│21.09.94│07 │20.09.94│ + + + │ + + + │ + + + │ + + + │ - - - │ + + - │ + + + │При- │ │ │ │ │ │к/N 123│ │ + + + │ + + + │ + + - │ + + + │ - - - │ + + - │ + + + │год- │ │ │ │ │ │ │ │ + + - │ + + + │ + + - │ + + - │ - - - │ + - - │ + + - │на │ │ │ └─┴────────┴───────┴────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴──────────────┴─────┴─────┴────┘
8. Испытание на токсичность
Настоящему испытанию подлежат препараты, предназначенные для внутривенного, внутримышечного и подкожного введения. Методы испытания на токсичность препаратов, вводимых человеку другими способами, излагают в частных фармакопейных статьях. Испытание проводят на двух видах животных: белых мышах обоего пола, массой 18 - 20 г, и морских свинках обоего пола, массой 250 - 350 г. В исследованиях должны быть использованы здоровые животные, содержащиеся в соответствии с действующими правилами, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Массу животных определяют в день начала испытания. 8.1. Испытание на белых мышах. Препарат вводят внутрибрюшинно 5-ти животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 1 мл, если в частной фармакопейной статье нет указаний на другую дозировку. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем, который вносят в объеме, указанном на этикетке. Если препарат предназначен для внутривенного введения, то его токсичность определяют при внутривенном введении, при этом испытуемая доза не должна превышать 0,5 мл, а скорость введения 0,1 мл/сек. Препарат, вводимый внутривенно, должен иметь температуру (36 +/- 1) °С. 8.2. Испытание на морских свинках. Препарат вводят подкожно 2 животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 10 мл, если в частной фармакопейной статье нет указаний на другую дозировку. Сухой препарат растворяют соответствующим растворителем, который вносят в объеме, указанном на этикетке. Если препарат предназначен для внутривенного введения, то его токсичность определяют при внутрибрюшинном введении, при этом испытуемая доза не должна превышать 5 мл. Препараты вводят стерильным шприцем, погрешность измерения которого не должна превышать 4%. Для введения объемов до 1 мл включительно используют шприцы, вместимостью 1 мл; свыше 1 мл - шприцы, вместимостью 2 или 5 мл. Наблюдение за животными осуществляют ежедневно в течение 7 сут. Препарат считают выдержавшим испытание, если: - в течение периода наблюдения все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания; - масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходной; - ни у одной морской свинки, получившей препарат подкожно, не развился некроз или абсцесс в месте введения (возможность развития других проявлений реакции в месте введения препарата указывают в частной фармакопейной статье). Если в течение периода наблюдения регистрируют гибель, заболевание, уменьшение массы, развитие некроза или абсцесса в месте введения хотя бы у одного животного, испытание должно быть повторено на удвоенном количестве животных того же вида. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям.
9. Испытание на пирогенность
Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола, на альбиносах, массой 1,5 - 2,5 кг, содержащихся на полноценном рационе. Кроликов отбирают за 5 дней до опыта. Каждого кролика содержат в отдельной клетке в помещении с постоянной температурой (допустимые отклонения +/- 3 °С). При уборке клеток и взвешивании животных их оберегают от возбуждения (избегать шума, стука, резких движений). Взвешивание кроликов производят через день до дачи корма, всего не менее 3-х раз. В течение срока, предшествующего опыту, кролики не должны терять в массе. Животные, теряющие в массе, к опыту не пригодны. В течение 3-х суток перед испытанием у каждого подопытного кролика измеряют температуру. Измерения производят ежедневно утром, до дачи корма, при помощи медицинского термометра или электротермометра, точность которого не должна уступать точности медицинского термометра. Датчик электротермометра или ртутные термометры вводят ректально за внутренний сфинктер на глубину не менее 5 см на время, необходимое для достижения максимальной температуры, но не менее чем на 5 мин. Измерение температуры следует проводить не ранее чем через 1 ч после фиксирования кроликов. Исходная температура подопытных кроликов должна быть в пределах 38,5 - 39,5 °С. Животные с более высокой или более низкой температурой для опыта не пригодны. За 24 ч до опыта кроликов переводят в помещение, в котором производят испытание на пирогенность. Испытание должно проводиться в отдельной комнате с постоянной температурой 18 - 22 °С, изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером накануне опыта у животных отбирают остаток корма. До опыта и во время опыта животные корма не получают (воду до опыта дают без ограничения). Испытуемый препарат проверяют на 3-х кроликах. Перед инъекцией испытуемого раствора температура кроликов измеряется не менее 2 раз с промежутками в 30 мин. Разница между результатами обоих измерений не должна превышать 0,2 °С. Средняя величина обоих измерений считается нормальной температурой и берется в основу определения повышения температуры. Шприцы, иглы и используемую стеклянную посуду стерилизуют в суховоздушном шкафу при температуре 180 °С в течение 60 мин. или кипятят в дистиллированной воде в течение 30 мин. Стерильный испытуемый препарат медленно вводят кроликам в ушную вену стерильным шприцем и иглой. Для каждого кролика берут отдельную иглу. Препарат вводят подогретым до (37 +/- 1) °С не более чем через 30 мин. после измерения исходной температуры. После введения препарата температуру измеряют 3 раза с промежутками 1 ч. Объем вводимого препарата и критерии оценки результатов испытания должны быть указаны в фармакопейных статьях на каждый испытуемый препарат. Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для определения пирогенности аналогичного препарата повторно (но всего не более 3-х раз) с интервалом 2 - 3 дня, если ранее введенный им препарат был апирогенным. Если введенный в первый раз препарат оказался пирогенным, кролики не могут быть использованы повторно.
10. Определение эндотоксина в тесте с лизатом амебоцитов
Принцип метода заключается в образовании геля при контакте лизата амебоцитов и эндотоксина. Чувствительность теста составляет 0,1 ЭЕ/мл, что значительно превышает чувствительность метода определения пирогенности на кроликах. 1 нг эндотоксина равен 5 ЭЕ (эндотоксинных единиц). Требования к его содержанию в вакцинных препаратах составляют не более 0,5 ЭЕ/мл. Референс-стандарт эндотоксина содержит 10000 ЭЕ во флаконе (5 мл). 10.1. Проведение реакции 10.1.1. Предварительный тест Готовят десятикратные разведения (с 1:10 по 1:100000) контрольного стандарта (референс-вакцины) и исследуемой вакцины в апирогенной дистиллированной воде в объеме 1 мл. Затем отбирают 0,1 мл из каждого разведения в агглютинационную пробирку (10 x 75 мм) и добавляют 0,1 мл лизата. Смесь инкубируют 1 ч в водяной бане при 37 °С. Разведение, в котором образовался твердый гель (гель остается в пробирке при ее переворачивании), принимают за положительный результат. 10.1.2. Заключительный тест Готовят 4 ряда по 5 пробирок двукратных разведений испытуемой вакцины. Исходным материалом служит разведение вакцины, которое в предварительном тесте дало положительный результат. Проводят реакцию так же, как предварительный тест. Высчитывают среднегеометрическую титров по результатам учета реакции в 4-х рядах. 10.1.3. Титрование референс-вакцины Готовят разведение референс-вакцины (неразвед. и с 1:1000 двукратные разведения по 1:32000). Проводят реакцию с лизатом, как и в предварительном тесте. Высчитывают среднегеометрическую титров по результатам учета реакции в 4-х рядах. Далее высчитывают отношение среднегеометрических значений вакцины и референс-вакцины. За положительный результат (соответствие требованиям) принимают соотношение, равное 1 или меньше 1. 10.1.4. Проведение теста, подтверждающего чувствительность лизата Готовят двукратные разведения эндотоксина с 1 ЭЕ/мл по 0,0312 ЭЕ/мл. Проводят реакцию с лизатом. Среднегеометрическая титров должна быть не менее 0,1 ЭЕ/мл.
11. Испытание на отсутствие посторонних агентов
Настоящему испытанию подлежат: производственные клеточные культуры; объединенный вирусный сбор, полученный при приготовлении вакцинного штамма, посевного вируса для живых и инактивированных вирусных вакцин; объединенный вирусный сбор каждой серии живых вирусных вакцин. В частных фармакопейных статьях на отдельные препараты, учитывая специфические особенности их производства, возможно введение дополнительных методов контроля. 11.1.1. Контроль производственной клеточной культуры Контролю подвергается не менее 500 мл клеточной суспензии в концентрации, используемой для посева клеточных культур - продуцентов вакцины. Клеточную суспензию разливают во флаконы, удобные для проведения контрольных исследований, но не менее двух. Клетки, отобранные в качестве контрольных, оставляют незараженными и инкубируют так же, как и клетки, используемые для производства вакцины до последнего сбора вирусов с культур-продуцентов, но не менее 14 сут. В конце периода наблюдения контрольные клеточные культуры исследуют под микроскопом на наличие цитопатических изменений (увеличение 70X). За время культивирования клеток не должно выявляться признаков дегенерации, вызываемых инфекционным агентом.
|
