МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ 7 страницаПросветленные полосы вставляют в денситометр так, чтобы против щели находился неокрашенный участок. Писчик денситометра устанавливают на нуль, после чего включают протягивающее и записывающее устройство. Записанную денситометром кривую делят на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого пика пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком. Соотношение между этими фракциями вычисляют по формуле площади прямоугольника (h x d, где h - максимальная высота пика, d - ширина пика, измеренная на уровне 1/2 высоты). Общую площадь прямоугольников принимают за 100% и вычисляют, какой процент по отношению к ней составляет площадь каждого прямоугольника. Примечания. 1. Подготовка пленки. Пленки смачивают в барбиталовом буферном растворе. Для этого пленку гладкой стороной помещают в кювету на поверхность буферного раствора на 2 мин., после чего ее погружают пинцетом на дно кюветы и выдерживают в течение 5 мин. Пленку вынимают пинцетом, избыток влаги удаляют, промокнув ее между двумя листами фильтровальной бумаги. На увлажненной пленке с матовой стороны формируют стартовые канавки (вдоль волокон), используя специальное устройство. Аналогичные операции проводят со второй пленкой. Пленки заправляют в рамки, избегая неравномерного натяжения и провисания. 2. Подготовка препаратов. Исследуемые препараты наносят на пленку дозирующим устройством. Предварительно эти препараты, подкрашенные бромфеноловым синим, заливают в каждую лунку лотка (краситель позволяет контролировать нанесение проб дозаторами и продвижение фракций). 3. Приготовление барбиталового буферного раствора (pH 8,4). 8,5 г барбитал-натрия помещают в мерную колбу, вместимостью 1 л. Навеску растворяют в 600 - 700 мл воды, прибавляют 11 мл соляной кислоты концентрации 1 моль/л и объем раствора доводят водой до метки. 4. Приготовление раствора соляной кислоты концентрации 1 моль/л. 85 мл концентрированной соляной кислоты помещают в мерную колбу, вместимостью 1 л. Объем раствора доводят водой до метки. 5. Приготовление красителя. К 0,5 г амидочерного 10Б (импортный) прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, 3 г трихлоруксусной кислоты и 90 мл спирта. Смесь для насыщения оставляют на 24 ч, периодически встряхивают. Раствор фильтруют. 6. Приготовление раствора для отмывки электрофореграмм. К 40 мл концентрированной уксусной кислоты прибавляют 700 мл воды, перемешивают. Затем объем раствора доводят водой до 1 л в мерном цилиндре. 7. Приготовление элюирующего раствора. 5 объемов раствора натрия гидроксида концентрации 1 моль/л смешивают с 0,5 объемами раствора трилона В концентрации 0,1 моль/л. 8. Приготовление раствора трилона Б концентрации 0,1 моль/л. 37,22 г трилона Б растворяют в 700 мл воды, перемешивают. Затем объем раствора доводят водой до 1 л в мерной колбе. 9. Приготовление раствора натрия гидроксида концентрации 1 моль/л. 40,0 г натрия гидроксида растворяют в 700 мл воды в фарфоровом стакане, после охлаждения раствор перемешивают, переливают в мерную колбу, вместимостью 1 л, и объем раствора доводят водой до метки.
24. Определение антигенного состава сывороточных препаратов методом иммуноэлектрофореза
Метод основан на способности заряженных частиц к перемещению в агаром геле или на пленках из ацетата целлюлозы в электрическом поле. В последующем проводят анализ полученных фракций методом двойной диффузии в агаре или на пленке. Антисыворотку вносят в траншею, расположенную параллельно направлению электрофоретического разделения белковых фракций. При встрече антигена с антителом образуются линии преципитации. По количеству этих линий судят о чистоте препарата. Метод рекомендован для препаратов иммуноглобулина. 24.1. Методика иммуноэлектрофореза в агаре Методика определения. На стеклянную пластину размером 120 x 90 мм наливают 18 - 20 мл расплавленного агара концентрации 1,25%, чтобы получился слой толщиной 2 - 3 мм. После застывания агарового геля вырезают лунки, используя для этого специальный штамп (рис. 1 - не приводится). Препараты вносят в лунки при помощи тонко оттянутого капилляра. В одну из лунок вносят нормальную сыворотку. В электродные камеры наливают барбиталовый буферный раствор (pH 8,2). Пластинки с агаровым гелем помещают в аппарат для электрофореза. На оба конца пластинок помещают полоски хроматографической или фильтровальной бумаги размером 120 x 60 мм, сложенной в 5 - 6 слоев, которые соединяют с электродными камерами. Электрофорез проводят при силе тока 10 мА и напряжении 100 В в течение 1,0 - 1,5 ч. После проведения электрофореза между лунками в агаровом геле вырезают траншеи и вносят в них антисыворотку, преципитирующую сывороточные белки. Пластинку помещают во влажную камеру, в которую ставят бюкс с водой и несколькими кристалликами фенола, через 24 - 48 ч пластинку вынимают из влажной камеры, погружают в кювету с 0,9%-ным раствором натрия хлорида (консервант - несколько кристалликов фенола) и отмывают в течение 2 - 3 сут. от белка, не принявшего участие в образовании преципитата. Раствор меняют 3 - 4 раза в сутки. Отмытые пластинки высушивают на воздухе. Для равномерного высушивания пластинки с агаровым гелем накрывают фильтровальной бумагой, бумагу над лунками и траншеями прокалывают иглой. Чтобы ускорить процесс высушивания, можно использовать вентилятор. После высушивания пластинки бумагу смачивают водой и удаляют. Пластинки с высушенным агаровым гелем окрашивают в течение 2 ч в растворе красителя. Оценивают локализацию и число линий преципитации препаратов иммуноглобулинов относительно линий преципитации сыворотки крови, которая должна проявлять не менее 15 линий преципитации с антисывороткой. Оценку качества каждой новой серии антисыворотки проводят со стандартным образцом тест-системы для определения антигенного состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза. Примечания. 1. Приготовление 1,25%-ного агарового геля. 12,5 г агара помещают в химический стакан, вместимостью 1 л, приливают 500 мл воды и оставляют для набухания геля в течение часа при температуре 18 - 20 °С. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят водой до 500 мл и затем добавляют равный объем барбиталового буферного раствора (pH 8,2) (концентрацию соли и кислоты, указанную в п. 2 следует увеличить в 2 раза). Раствор агара фильтруют через марлю (2 - 3 слоя), прибавляют мертиолят до концентрации 100 мкг/мл и разливают во флаконы по 40 - 50 мл (количество, необходимое на две пластинки). Расплавленный агар должен быть прозрачным. Рекомендуется использовать отечественный агар высокоочищенный (ВФС 42-90 ВС-87), а также агар иностранных фирм (например, агар Дифко). 2. Приготовление барбиталового буферного раствора (pH 8,2). 47,6 барбитал-натрия и 69 мл соляной кислоты концентрации 1 моль/л растворяют в 4,3 л воды. 3. Обработка стеклянных пластинок. На стеклянные пластинки (лучше использовать фотопластинки), обработанные хромовой смесью, наносят несколько капель расплавленного 1,25%-ного агара и растирают тонким слоем (чтобы агаровый гель лучше прилипал к стеклу). Пластинку высушивают при температуре 75 - 80 °С. 4. Приготовление пластинок с агаровым гелем. Стеклянные пластинки помещают на горизонтальную поверхность и наливают расплавленный при температуре 60 - 80 °С 1,25%-ный агар осторожно, без образования пузырьков воздуха. В геле вырезают лунки для анализируемых проб, а после проведения электрофореза - траншеи для преципитирующей иммунной сыворотки (рис. 1 - не приводится). Траншеи вырезают специальным резцом, лунки для антигена вырезают поперечно-срезанным концом пастеровской пипетки. Лунки и траншеи можно вырезать, положив пластинку на бумагу с нанесенным рисунком, или используют специальный штамп (коробочка со съемной металлической крышкой, на которой вырезаны траншеи и лунки). 5. Состав красителя: амидочерный 10Б - 1,0 г, 450 мл раствора уксусной кислоты концентрации 0,1 моль/л, 550 мл раствора натрия ацетата концентрации 0,1 моль/л. 6. Приготовление 2%-ного раствора уксусной кислоты. 20 мл ледяной уксусной кислоты вносят в мерный цилиндр, вместимостью 1 л, объем раствора доводят водой до метки.
24.2. Метод иммуноэлектрофореза на пленках из ацетата целлюлозы Методика определения. На увлажненной буферным раствором пленке из ацетата целлюлозы формируют стартовые канавки и продольные траншеи, используя для этого специальное устройство (штамп). На пленку наносят препараты, проводят электрофорез, как указано в методике 23 ("Определение однородности сывороточных препаратов методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы"). После проведения электрофореза по линии траншей помещают узкие полоски (1 x 4,5 мм) фильтровальной бумаги, пропитанные антисывороткой. Пленку на рамке оставляют во влажной камере в течение 24 ч, после чего пленку 3 - 4 раза отмывают от избытка антисыворотки 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Пленку окрашивают красителем, промывают, высушивают, просветляют в вазелиновом масле и оценивают результаты, как указано в методике (23, 24). Для окрашивания линий преципитации, помимо красителя амидочерного 10Б, можно использовать 1%-ный раствор фуксина кислого в растворе уксусной кислоты концентрации 2 моль/л. Время выдерживания пленки с красителем составляет 3 - 5 мин. Избыток красителя отмывают в растворе уксусной кислоты концентрации 1 моль/л. Примечание. Приготовление красителя на основе фуксина кислого. К 1 г фуксина кислого прибавляют 10 мл ледяной уксусной кислоты, 3 г трихлоруксусной кислоты и 90 мл спирта. Смесь для насыщения оставляют на 24 ч, периодически встряхивают.
25. Определение агрегатов и фрагментов в препаратах иммуноглобулина методом гель-фильтрации
Метод гель-фильтрации основан на разделении препарата на фракции в зависимости от размера и молекулярной массы белковых компонентов, входящих в его состав. Препараты иммуноглобулинов фракционируют на хроматографической колонке с сефадексом G-200 или на ультрагеле АсА-34 и определяют процентное содержание следующих фракций: полимеров, димеров, мономеров, фрагментов. Методика определения. Для проведения анализа рекомендуется использовать комплекс оборудования, включающий: холодильную камеру, коллектор фракций, анализатор с проточной кюветой (увикорд), самописец и перистальтический насос. В колонку 100 x 2,5 см с сефадексом G-200 или ультрагелем АсА-34 вносят 1 - 3 мл 5%-ного раствора иммуноглобулина. До концентрации 5% препарат разводят трис-буферным раствором (pH 8,0 - 8,2). Фракционирование препарата проводят в течение 12 - 14 ч со скоростью 15 - 20 мл/ч. Объем жидкости в каждой пробирке должен составлять 5 - 7 мл. При отсутствии автоматической системы измеряют оптическую плотность содержимого каждой пробирки на спектрофотометре при длине волны 280 нм в кювете толщиной слоя 10 мм. Распределение белковых фракций выражают графически. Сливают в отдельные емкости содержимое пробирок, соответствующих каждой фракции препарата, измеряют их объем и определяют оптическую плотность. Делают разведение фракций препарата, если показатель величины оптической плотности превышает оптимальную зону работы прибора. Рассчитывают суммарную оптическую плотность (Э) для каждой фракции препарата по формуле:
Э = D280 x Vx x Рx,
где: D280 - оптическая плотность фракции; Vx - объем фракции; Px - разведение фракции. Сумму оптической плотности всех фракций принимают за 100%. Вычисляют процентное содержание каждой фракции в препарате по отношению к полученной сумме. Для установления последовательности выхода каждой фракции препарата и нахождения молекулярной массы проводят калибрование колонки с гелем по стандартным белкам-калибрантам: ферритину (молекулярная масса - М.м. - 440000), каталазе (М.м. - 232000), альдолазе (М.м. - 158000), бычьему сывороточному альбумину (БСА, М.м. - 67000), овальбумину (М.м. - 43000). Объем раствора стандартного белка, наносимого на колонку, должен составлять 1 - 2% от общего объема колонки. Раствор ферритина готовят в концентрации 1 мг/мл, а растворы каталазы, альдолазы, БСА и овальбумина готовят в концентрации 5 - 10 мг/мл. Измеряют объем выхода (Ve) каждого калибранта. Вычисляют общий объем колонки с гелем (Vt) по формуле:
Vt = пи r h,
где: пи = 3,14, r = 1,25 см, h - высота столба геля, см. Рассчитывают значение коэффициента распределения (Кav) для каждого белка по формуле:
Ve - Vo Kav = -------, Vt - Vo
где: Ve - объем выхода фракции калибранта, мл; Vo - свободный объем, равный объему выхода фракции голубого декстрана, мл; Vt - общий объем колонки с гелем, мл. Строят график зависимости коэффициента распределения (Кav) от десятичного логарифма (lg) молекулярной массы каждого калибранта. Примечания. 1. Приготовление геля сефадекса G-200. 18 - 20 г сефадекса G-200 помещают в химический стакан или цилиндр с водой (800 - 1000 мл) и оставляют набухать при температуре 18 - 22 °С в течение 3-х сут. После этого проводят декантацию надосадочной жидкости. Наливают новую порцию воды, содержимое стакана осторожно перемешивают стеклянной палочкой и оставляют для оседания геля. Декантацию проводят до тех пор, пока в надосадочной жидкости не останется мелких частиц геля, которые могут закупорить колонку. Измеряют высоту столба полностью осевшего геля и наносят метку на уровне, на половину превышающем высоту осадка геля сефадекса G-200. Удаляют жидкость до метки. Содержимое осторожно перемешивают стеклянной палочкой до получения гомогенной суспензии, которую полностью выливают в хроматографическую колонку с воронкой. 2. Приготовление геля сефадекса G-25. 1,0 - 1,5 г сефадекса G-25 помещают в пробирку с 8 - 10 мл воды и оставляют набухать при температуре 18 - 22 °С в течение 3,0 - 3,5 ч. После этого проводят операции, аналогичные приготовлению сефадекса S-200. 3. Приготовление суспензии ультрагеля АсА-34. 400 мл ультрагеля АсА-34 помещают в химический стакан или цилиндр, вместимостью 1000 мл, добавляют 160 мл трис-буферного раствора, составляющего 40% от объема геля, осторожно перемешивают содержимое стеклянной палочкой до получения однородной суспензии. Рекомендуется удалять под вакуумом растворенный газ из полученной суспензии. 4. Приготовление трис-буферного раствора (pH 8,0 - 8,2). В цилиндр, вместимостью 1000 мл, наливают 200 - 300 мл воды и помещают 6,06 г трис-(оксиметил)-аминометана и 58,5 г натрия хлорида, перемешивают и прибавляют 275 мл раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/л. После растворения реактивов объем раствора доводят водой до метки. Буферный раствор фильтруют и хранят при температуре 4 - 8 °С. 5. Заполнение колонки. Колонку закрепляют в вертикальном положении и закрывают нижнее отверстие. В верхнее отверстие колонки вставляют воронку с притертым шлифом или резервуар с насадкой. Всю подготовленную гомогенную суспензию гель-сефадекса или ультрагеля по стеклянной палочке выливают в колонку. После того, как осевшие частицы геля образуют слой высотой 5 - 10 см, открывают нижнее отверстие колонки. Продолжают заполнять колонку до тех пор, пока высота сформировавшегося столба не составит 75 - 95 см. Закрывают нижнее отверстие колонки (при работе с гелем сефадекса G-200 наслаивают слой сефадекса G-25 высотой 5 - 7 мм). Соединяют верхнее отверстие колонки с резервуаром буферного раствора, открывают нижнее отверстие и промывают ее 2 - 3-кратным объемом буферного раствора. Высота резервуара с буферным раствором по отношению к уровню выхода капли жидкости из колонки не должна превышать 250 - 300 мм. При наличии перистальтического насоса данное требование не соблюдают. 6. Внесение вещества в колонку. Удаляют жидкость над столбом геля путем отсасывания или открывают нижнее отверстие колонки. Наслаивают исследуемое вещество пипеткой по стенке колонки, при этом нижнее отверстие колонки должно быть закрыто. Соединяют нижнее отверстие колонки с коллектором фракций или с автоматической системой для гель-фильтрации. Открывают нижнее отверстие колонки, включают автоматическую систему или коллектор фракций. Дают возможность исследуемому веществу впитаться в верхний слой геля. Закрывают нижнее отверстие колонки и промывают буферным раствором верхнюю часть колонки, осторожно наслаивая его по 4 - 5 мл 2 - 3 раза на поверхность геля. Операция внесения препарата в колонку значительно упрощается при наличии адаптеров. При помощи перистальтического насоса вещество по соединительной трубке поступает непосредственно в колонку. 7. Проверка правильности заполнения колонки. Определение правильности заполненной колонки проводят с помощью свежеприготовленного 0,2%-ного раствора. 8 - 10 мг голубого декстрана (молекулярная масса 2 x 10) растворяют в 4 - 5 мл буферного раствора, вносят в колонку и проводят гель-фильтрацию, как указано выше. Качество заполнения колонки оценивают по графическому изображению фракции голубого декстрана. Пик фракций должен начинаться под углом 93 - 98° и заканчиваться прямой линией, в противном случае колонку следует заполнить заново. Проверку правильности заполненной колонки проводят каждый раз при новом ее заполнении. 8. Определение свободного объема (Vo) колонки. Свободный объем равен объему жидкости, собранной с момента внесения вещества в колонку до появления пика фракции, соответствующей максимуму элюции голубого декстрана. 9. Хранение геля в колонке. Через колонку, заполненную гелем, пропускают трис-буферный раствор, содержащий 0,02%-ный раствор натрия азида, со скоростью 10 - 12 мл/ч, закрывают верхнее и нижнее отверстия колонки и хранят ее при постоянной температуре. Перед использованием вновь хроматографическую колонку промывают 2 - 3-кратным объемом буферного раствора.
26. Определение агрегатов в препаратах иммуноглобулина с применением полиэтиленгликоля
Метод основан на способности полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 и 6000 осаждать агрегаты (полимеры) из препаратов иммуноглобулинов. Метод может быть использован для определения агрегатов (полимеров) в полуфабрикатах препаратов иммуноглобулинов. Методика определения. Иммуноглобулин разводят до 1%-ной концентрации боратным буферным раствором pH 8,0. К 1 мл полученного раствора добавляют 2 мл 7%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 или 4,7%-ного раствора с молекулярной массой 6000. Пробы оставляют на 2 ч при температуре (20 +/- 5) °С. Осадок отделяют центрифугированием в течение 40 мин. при 3500 - 4000 об./мин. при температуре 4 - 8 °С. Центрифугат удаляют, осадок растворяют в 3 мл 0,09 моль/л раствора натрия гидроксида и перемешивают. Измеряют оптическую плотность опытной пробы на спектрофотометре при длине волны 280 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм против раствора, содержащего 0,5 мл боратного буферного раствора и 14,5 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида. Одновременно готовят раствор контрольной пробы: к 0,5 мл 1%-ного раствора иммуноглобулина добавляют 14,5 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида. Измеряют оптическую плотность контрольной пробы, как описано выше, по сравнению с раствором, содержащим 0,5 мл боратного буферного раствора и 14,5 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида. Содержание агрегатов (полимеров) в препаратах иммуноглобулина с учетом объема и разведения проб рассчитывают по формуле:
Dопыт x 3 Dопыт x 10 X = ----------- x 100 = ----------, Dконтр x 30 Dконтр
где: Dопыт - оптическая плотность опытной пробы; Dконтр - оптическая плотность контрольной пробы; 3 - разведение опытной пробы; 30 - разведение контрольной пробы. Примечания. 1. Приготовление 1 моль/л раствора натрия гидроксида. 40 г натрия гидроксида помещают в фарфоровый стакан и растворяют в 500 мл дистиллированной воды, после растворения щелочи раствор переливают в мерную колбу, вместимостью 1000 мл, и доводят объем раствора водой до метки. 2. Приготовление 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида. 100 мл 1 моль/л раствора натрия гидроксида наливают в мерную колбу, вместимостью 1000 мл, и доводят объем раствора водой до метки. 3. Приготовление 0,09 моль/л раствора натрия гидроксида. 90 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида наливают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, и доводят объем раствора водой до метки. 4. Приготовление боратного буферного раствора pH 8,0: а) приготовление раствора N 1. 12,4 г борной кислоты помещают в мерную колбу, вместимостью 1000 мл, добавляют 100 мл 1 моль/л раствора натрия гидроксида, перемешивают и после растворения кислоты доводят объем раствора водой до метки; б) приготовление 0,1 моль/л раствора соляной кислоты. В мерную колбу, вместимостью 1000 мл, наливают 500 мл дистиллированной воды и 8,25 мл концентрированной соляной кислоты (пл - 1,185), осторожно перемешивают и доводят объем раствора водой до метки. Для приготовления 0,1 моль/л раствора соляной кислоты можно использовать растворы фиксаналов. В мерную колбу, вместимостью 1000 мл, наливают 350 мл раствора N 1 и 450 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты, перемешивают и доводят объем раствора водой до метки, раствор имеет pH 8,0 +/- 0,1. 5. Приготовление 7%-ного раствора полиэтиленгликоля 4000. 7 г полиэтиленгликоля 4000 помещают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл боратного буферного раствора, перемешивают и после растворения доводят объем этим же раствором до метки. 6. Приготовление 4,7%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. 4,7 г полиэтиленгликоля 6000 помещают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, добавляют 50 мл боратного буферного раствора, перемешивают и после растворения доводят объем этим же раствором до метки.
27. Определение молекулярных параметров полисахаридов
Молекулярные параметры полисахаридов оценивают методом гель-фильтрации на колонке с сефарозой 4В. Выход полисахарида в объеме элюата до Kd = 0,5 выражают в процентах по отношению к общему количеству полисахарида, вышедшему с колонки. Метод рекомендован для менингококковых и других полисахаридных вакцин. Методика определения. В колонку размером 90 x 1,5 см с сефарозой В вносят 1 мл 0,5%-ного раствора исследуемого препарата (раствор препарата готовят, используя буферный солевой раствор pH 7,4). Фракционирование препарата проводят со скоростью 15 - 20 мл/ч, используя для элюции буферный солевой раствор. Собирают фракции по 2 мл. Вычисляют объем элюата (Ve в мм) фракции, соответствующей Кd = 0,5 по формуле:
Ve = Vo + 0,5 x (Vt - Vo),
где: Vo - свободный объем колонки, мл; Vt - общий объем колонки с гелем, мл; 0,5 - коэффициент распределения вещества (Кd) на колонке. Фракции элюата объединяют в два пула. Первый пул включает фракции, начиная с той, которая соответствует Vo, до фракции, соответствующей Kd = 0,5. Второй пул включает последующие фракции до той, которая соответствует Vt. В каждом из пулов определяют содержание фосфора, используя для анализа 1 мл. Определение проводят по методу, изложенному в разделе "Определение фосфора", за исключением следующего: для анализа используют весь минерализат, объем которого доводят водой до 4 мл; для колориметрирования используют кюветы с толщиной слоя 5 мм. Содержание фосфора в обоих пулах принимают за 100%. Выход полисахарида в процентах в объеме элюата до Kd = 0,5 равен процентному содержанию фосфора в первом пуле. Примечания. 1. Приготовление геля сефарозы 4В. 250 - 300 мл геля сефарозы 4В заливают 500 - 600 мл буферного солевого раствора (pH 7,4), перемешивают, переносят в цилиндр, вместимостью 1 л, и оставляют на 2 - 3 мин. для осаждения крупных частиц геля. Надосадочный слой переливают в другой цилиндр, а крупные частицы геля отбрасывают. Операцию повторяют 2 - 3 раза. Затем суспензию геля оставляют в цилиндре на 1,0 - 1,5 ч. Надосадочную жидкость с очень мелкими частицами геля удаляют декантацией. Операцию повторяют 2 - 3 раза, прибавляя 500 - 600 мл свежей порции буферного солевого раствора до тех пор, пока в надосадочной жидкости не останется мелких частиц геля. 2. Приготовление буферного солевого раствора (pH 7,4). Смешивают 250 мл раствора трис-(оксиметил)-аминометана (х.ч.) концентрации 0,1 моль/л. 200 мл раствора соляной кислоты (х.ч.) концентрации 0,1 моль/л и 550 мл воды. К 1 л смеси прибавляют 11,7 г натрия хлорида (х.ч.). Раствор имеет pH 7,4. 3. Заполнение колонки. Колонку закрепляют в вертикальном положении, закрывают нижнее отверстие и заполняют буферным солевым раствором до высоты 30 - 35 см. В верхнее отверстие колонки вставляют насадку с резервуаром. Весь приготовленный гель сефарозы вносят в резервуар, осторожно сливая его по стенке. Устанавливают уровень выхода капли из колонки на высоте 70 - 75 см от уровня геля в резервуаре и открывают нижнее отверстие. После того, как сформируется слой геля высотой 89 - 85 см, резервуар отсоединяют и колонку соединяют с резервуаром, заполненным буферным солевым раствором; промывают колонку 2 - 3 объемами буферного солевого раствора при том же рабочем давлении. 4. Внесение препарата в колонку. Препарат вносят в колонку, как указано в методике "Определение агрегатов и фрагментов в препаратах иммуноглобулина методом гель-фильтрации". 5. Проверка качества заполнения колонки. На колонку наносят 1 мл свежеприготовленного 0,5%-ного раствора голубого декстрана в буферном солевом растворе и проводят гель-фильтрацию, как указано в разделе 25. Измеряют оптическую плотность фракции на спектрофотометре при длине волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Правильность заполнения колонки оценивают по графическому изображению фракции голубого декстрана. Пик фракции должен начинаться под углом 93 - 98° и заканчиваться прямой линией. 6. Определение свободного объема (Vо) колонки. Vо определяют по объему выхода голубого декстрана. Vo равен объему элюата, собранному с момента внесения вещества в колонку до появления фракции, соответствующей максимуму пика при элюции голубого декстрана. 7. Определение общего объема (Vt) колонки. Vt определяют по объему выхода натрия азида. На колонку наносят 1 мл 1%-ного раствора натрия азида (импортного), приготовленного с использованием буферного солевого раствора. Гель-фильтрацию и анализ фракций проводят, как указано в разделе 25. Vt равен объему элюата, собранному с момента внесения вещества на колонку до появления фракции, соответствующей максимуму пика при элюции натрия азида.
28. Определение степени расщепления белковых препаратов по наличию низкомолекулярных фракций, неосаждаемых трихлоруксусной кислотой
Метод основан на определении низкомолекулярных белковых фракций по цветной реакции циклических аминокислот с реактивом Фолина. Содержание низкомолекулярных фракций выражают количеством тирозина. Метод предназначен для анализа антитоксических сывороток. Методика определения. В центрифужную пробирку вносят 0,1 мл антитоксической сыворотки, добавляют 2,9 мл дистиллированной воды и 2,5 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Пробы оставляют на 18 - 20 ч при 4 - 8 °С. Осадок отделяют центрифугированием при 2000 об./мин. при 5 °С в течение 30 - 40 мин. Прозрачную надосадочную жидкость осторожно сливают в чистую пробирку. К 0,5 мл надосадочной жидкости добавляют 1,5 мл воды, 2 мл натрия гидроксида в концентрации 1 моль/л и 1 мл реактива Фолина (в разведении 1:3). Параллельно готовят контрольную пробу, содержащую все вышеуказанные реактивы, кроме надосадочной жидкости; в пробу добавляют 0,5 мл раствора ТХУ в концентрации 4,5%. Все пробы оставляют на 30 мин. и затем на спектрофотометре измеряют оптическую плотность испытуемых проб по отношению к контрольной пробе при длине волны 750 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Содержание низкомолекулярных фракций выражают количеством тирозина в мг/мл и рассчитывают по формуле:
а x 5,5 x 1,0 а x 110 X = ---------------- = -------, 0,5 x 0,1 x 1000 1000
где: а - количество тирозина, найденное по калибровочному графику, мкг; 0,5 - количество надосадочной жидкости, взятое для колориметрирования, мл; 5,5 - разведение исходного препарата при осаждении белка; 0,1 - количество препарата, взятое на осаждение белка, мл; 1,0 - пересчет тирозина на 1 мл препарата; 1000 - перевод мкг в мг. Калибровочный график. 0,1 - 0,5 мл (с интервалом 0,1 мл) стандартного раствора помещают в пробирки. Объем проб доводят до 0,5 мл 4,5%-ным раствором ТХУ, добавляют 2 мл 1 моль/л раствора натрия гидроксида и 1 мл реактива Фолина (в разведении 1:3). Оптическую плотность проб измеряют на спектрофотометре против контрольной пробы, содержащей все реактивы, указанные выше, кроме стандартного раствора; в эту пробу добавляют 0,5 мл 4,5%-ного раствора ТХУ. Строят калибровочный график, откладывая на оси ординат соответствующие величины оптической плотности, а на оси абсцисс - количество тирозина (мкг). Примечания. 1. Приготовление 10%-ного раствора ТХУ. К 10 мл 80%-ного раствора ТХУ добавляют 70 мл дистиллированной воды. 2. Приготовление 4,5%-ного раствора ТХУ. К 25 мл 10%-ного раствора ТХУ добавляют 30 мл воды.
|
