ДЕТЕКТИРОВАНИЕ

Для получения информации о качественном и количественном составе анализируемой смеси используют различные методы детектирования - как химические, так и физические. В последние годы значительно возросло использование ферментативных методов, особенно в клинической диагностике, при определении пестицидов.

Идентификацию веществ (качественный анализ) можно проводить по равенству значений Rf анализируемого вещества и стандарта ("свидетеля"). Если на хроматограмме образуются окрашенные зоны, то это значительно упрощает ее обработку. Невидимые хроматограммы проявляют (находят зоны разделенных веществ) химическими и физическими способами.

При химическом способе пленку или бумагу опрыскивают раствором или держат в парах взаимодействующего с компонентами анализируемой смеси реагента. Эти реактивы разделяют на два типа:

1) реактивы общего назначения, позволяющие обнаружить большое число соединений различных классов;

2) более специфичные реактивы, позволяющие обнаружить соединения определенного класса или с определенной функциональной группой.

Таблица 1. Реагенты для обнаружения некоторых органи­ческих соединений Класс со- Реагент Окраска пятен единений   Кислоты Бромкрезоловый Зеленое пятно на зеле-   зеленый ном фоне Спирты Церийаммонийнит- Коричневое пятно на   рат зеленом фоне   8-Оксихинолинат Красное пятно на зе-   ванадия(У) леном фоне Альдегиды 2,4-Динитрофенил- От желтого до красно-   гидразин го на бледно-оранже­вом фоне Амины Тиоцианат кобальта Голубое пятно на ро­зово-белом фоне   4-Хлор-5,7-динит- Оранжево-красные,   робензофуразан зеленые, синие пятна Фенолы Хлорид железа (III) Красно-фиолетовое

К реагентам общего назначения относятся концентрированная серная кислота, раствор бихромата калия в концентрированной серной кислоте, 1%-ный спиртовый раствор иода, фосфорно-молибденовая кислота, родамин. Одно из существенных преимуществ ТСХ по сравнению с бумажной хроматографией - возможность использования агрессивных проявителей.

Примеры специфичных реагентов-проявителей для обнаружения различных классов органических соединений приведены в табл. 1.

Примером селективного реагента, позволяющего визуально по окраске пятен обнаруживать присутствие аминосоединений различной природы в смесях, является 4-хлор-5,7-динитробензофуразан (рис. 3) [4]:

 

4-Хлор-5,7-динитробензофуразан

Для обнаружения бесцветных веществ, в первую очередь, следует воспользоваться физическими методами, основанными на поглощении света и флуоресценции При физическом способе проявления зон пластинку облучают УФ-лучами. Сорбент обычно содержит флуоресцентные индикаторы (силикаты цинка, сульфиды цинка или кадмия, вольфраматы щелочноземельных металлов), и пластина при облучении светится бледно-голубым светом. Если на пластинке есть вещества, способные поглощать УФ-излучение (ароматические и содержащие сопряженные С=С-связи вещества), то происходит ингибирование флуоресценции. Поэтому на ярком фоне пластинок появляются темные зоны, соответствующие определяемому соединению.

Более информативная идентификация веществ достигается при использовании спектральных методов детектирования (спектрофотометрия, флуориметрия, ИК-спектроскопия). Совпадения спектральных характеристик анализируемых и эталонных веществ является подтверждением их идентичности. Реакции ингибирования ферментативных реакций на хроматографической пластинке также используются для идентификации веществ.

Количественный анализ осуществляют непосредственно на хроматограмме (на слое сорбента или бумаге чувствительность определения зависит не только от условий разделения. Например, чем меньше Rf анализируемого вещества, тем менее размыта зона.

Для количественной оценки содержания вещества в хроматографических зонах используют различные методы:

1. Определение с удалением хроматографической зоны с пластинки можно проводить двояким образом: переносом хроматографической зоны вместе с сорбентом либо экстрагированием хроматографической зоны со слоя сорбента.

2. Определение соединений непосредственно на пластинке методом визуального сравнения размеров площадей пятен и их окраски с соответствующими параметрами пятен стандартных образцов

3. Метод денситометрии, повышающий точность результатов определения, основан на сканировании хроматограмм в видимом и УФ- свете с помощью «хроматографических спектрофотометров» - денситометров. Денситометры позволяют измерять поглощение света веществом на хроматограмме в режиме пропускания или отражения, а также флуоресценцию и ее тушение. Режим пропускания доступен, если только исследуемое вещество имеет полосу поглощения в видимой области спектра. В УФ-области регистрацию в режиме пропускания осуществить нельзя из-за собственного поглощения силикагеля и подложки хроматограммы.

4. Метод видеоденситометрии - сравнительно новый метод для количественной обработки хроматограмм. Принцип метода заключается во введении изображения хроматограммы в компьютер с помощью видеокамеры или цифровой камеры с последующим сравнением интенсивностей пятен стандартных и определяемых соединений. Приблизительный

Количественную обработку пятна в видеоденситометрии проводят по двум характеристикам: по площади пятна и его «объему» в пространстве, при этом в качестве третьей координаты используют яркость (интенсивность окраски пятна) (рис. 32).

Рис. 32. Вид пространственного распределения яркости в области пятна: Ау - значение уровня яркости точки пятна; Ву- значение уровня яркости точки на базовой поверхности.

 

 

5. Денситометрия с планшетным сканером с программным обеспечением для обработки хроматограмм практически не отличающимся от стандартных программ, применяемых для видеоденситометров, но существенно меньшей стоимости. При этом сканирование дает более четкое изображение хроматографических зон, что можно объяснить пониженным влиянием неравномерности освещения анализируемых объектов, чем в случае видеоденситометра.