Влияние температуры и pH на активность a-амилазы

Цель работы: изучение некоторых свойств фермента a-амилазы.

Оборудование, реактивы и материалы: аналитические и технические весы, термостаты, термометр, центрифуга, стеклянная воронка, бумажные фильтры, мерные колбы на 100 см³, пробирки, на 1, 2, 10 и 20 см³, бюретка, пробирка с эталоном (стандартным образцом декстринов с йодом), закрепленная на бумажном экране, с обратной стороны которого помещается электрическая лампочка; раствор уксусной кислоты с концентрацией 1 моль/дм³ (60 г ледяной уксусной кислоты растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды), кварцевый песок, раствор ацетата натрия с концентрацией 1 моль/дм³ (136 г водного ацетата натрия растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды), раствор КН₂РО₄ с концентрацией 1 моль/дм³ (9, 078 г КН₂РО₄ растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды), раствор Na₂HPO₄ с концентрацией 1 моль/дм³ (11, 876 г Na₂HPO₄ · 12 Н₂О растворяют в 1 дм³ дистиллированной воды), основной йодный раствор (11 г кристаллического йода растирают с 22 г йодита калия, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 см³ и доливают до метки дистиллированной водой), рабочий йодный раствор (8 см³ основного йодного раствора, 80 г йодита калия вносят в мерную колбу на 2 дм³, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки), стандартный образец (25 г CoCl₂ и 3, 84 K₂CrO₇ растворяют в 100 см³ раствора соляной кислоты с концентрацией 0, 01 моль/дм³), раствор крахмала с массовой долей 2 % (20 г крахмала растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, кипятят оставшуюся воду и осторожно, так, чтобы не прекращалось кипение вливают растворенный крахмал в кипящую воду. Объем дистиллированной воды 980 см³); солодовая вытяжка (к 4 г тонкоизмельченного солода прибавляют 100 см³ дистиллированной воды и экстрагируют в течение 1 ч при 30 ⁰С, полученную суспензию фильтруют через складчатый фильтр или центрифугируют. Прозрачный фильтрат используют как источник a-амилазы), раствор ферментного препарата (0, 1 г ферментного препарата растворяют в 100 см³ дистиллированной воды).

Теоретические сведения

 

Амилазы - ферменты, гидролизующие крахмал, широко применяются в спиртовой промышленности для осахаривания крахмалистого сырья, в хлебопечении для увеличения в тесте сбраживаемых сахаров.

Фермент a-амилаза относится к классу гидролаз, подклассу гликозидаз. Содержится в организме животных и человека (в слюне, соке поджелудочной железы), плесневых грибах и других микроорганизмах, солоде (проросшем зерне) пшеницы, ячменя, ржи, проса.

a-Амилаза гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах глубинные a-1-4-гликозидные связи без определенного порядка. При этом образуются декстрины и небольшое количество мальтозы, поэтому a-амилазу называют ферментом декстринирующего действия.

Метод определения активности a-амилазы основан на качественной реакции продуктов гидролиза – декстринов с раствором йода (в результате гидролиза интенсивная синяя окраска крахмала с йодом переходит в винно-красную).

 

Ход работы

 

В колбу на 100 см³ вносят пипеткой 20 см³ раствора крахмала и 8 см³ буферных растворов для создания определенного значения рН. Объем буферных растворов для разных значений рН представлен в таблице. Затем буферную смесь и крахмал помещают на водяную баню и прогревают при заданной температуре (20 и 50 °С) в течение 5-8 мин. Затем в колбу (не вынимая из бани) добавляют 2 см³ солодовой вытяжки или раствора фермента и перемешивают. Записывают время внесения фермента (начало гидролиза).

 

Растворы, см3	рН среды
4, 0	5, 0	6, 0	7, 0	8, 0
СНЗСООН	6, 9	2, 7	0, 4	–	–
СНЗСООNа	1, 1	5, 3	7, 6	–	–
NаН2РO4.12Н2О	–	–	–	4, 8	7, 6
КН2РO4	–	–	–	3, 2	0, 4

 

Через определенные промежутки времени отбирают по 1 см³ гидролизной смеси, вносят ее в пробирку с 5 см³ рабочего йодного раствора, встряхивают, сравнивают с эталоном. Сопоставлять окраску удобно на фоне экрана, освещенного с обратной стороны электрической лампой. Когда очередная проба гидролизата с рабочим йодным раствором дает окраску, идентичную с эталоном, гидролиз заканчивается. Записывают время его окончания.

Декстринирующая активность А, ед/г, определяется по формуле

,

 

где 0, 4 – навеска крахмала в 20 см³ раствора с массовой долей 2 %;

60 – пересчет минут в часы;

V – объем раствора фермента или экстракта, взятый для

гидролиза, см³;

t – время декстринизации, мин;

n – содержание фермента или солода в 1 см³ раствора или

экстракта, г.

 

Пример расчета. Для экстракции фермента была взята навеска солода массой 4 г, добавлено 100 см³ дистиллированной воды. Это соответствует содержанию солода в 1 см³ экстракта 0, 04 г. Объем экстракта для гидролиза крахмала составил 2 см³. Время окончания гидролиза - 20 мин. Следовательно, декстринирующая активность солода равна

 

ед/г

 

Оформление результатов

Полученные данные вносят в таблицу, активность фермента выражают в процентах от максимальной.

 

Температура, °С	Показатели	рН
4, 0	5, 0	6, 0	7, 0	8, 0
	Время декстринизации, мин Активность, ед/г Активность, %
	Время декстринизации, мин Активность, ед/г Активность, %

 

На основании данных таблицы строят график зависимости А = f(рН) для всех исследуемых температур и определяют оптимальные режимы работы a-амилазы солода.

 

Контрольные вопросы и задания

 

1. Что является субстратом для a-амилазы и какие связи в молекуле субстрата она гидролизует?

2. Что такое декстрины? Как определить декстринирующую активность солода?

3. В чем суть метода определения активности a-амилазы?

4. Какое значение имеет a-амилаза в технологии хлебопечения, пивоварении, спиртовом производстве?

5. 2, 0 мг a-амилазы, за 10 мин при температуре 38 °С и рН 6, 0 катализировал образование 40 мкМ декстринов. Рассчитайте удельную активность амилазы. Объясните, как и почему изменится (уменьшится, увеличится) активность фермента, если инкубационную среду подкислить до рН 4, 0 и температуру среды повысить до 75 °С.

 

Лабораторная работа № 21