Физические и химические методы молекулярной биологии.

Хроматография. Метод изобретен русским ученым М.С. Цветовым в 1906 г. Используется для очистки, фракционирования и анализа структуры белков, нуклеиновых кислот и их компонентов. В настоящее время существует большое количество вариантов хроматографии. В любом из них используется наличие двухфазной системы, в которой одна фаза неподвижна, а другая перемещается относительно нее с некоторой скоростью в одном направлении. Неподвижная фаза остается неизменной, заполняя полость трубки (хроматографической «колонки») или фиксируясь на поверхности стеклянной или пластиковой пластинки (иногда вместо нее используется фильтровальная бумага или пленка ацетилцеллюлозы). Подвижная фаза непрерывно изменяется, поступая в систему с одного ее конца и покидая с другого. (Неподвижная фаза может быть твердой или жидкой, подвижная – жидкой или газообразной. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают «жидкостную» или «газовую» хроматографию).

Молекулы компонентов исходной смеси веществ распределяются между двумя фазами в соответствии со степенями своего сродства к ним. Скорость миграции зависит от соотношения степеней сродства вещества к неподвижной и подвижной фазам.

Варианты хроматографии различаются по природе сродства фракционируемых молекул к хроматографическим фазам. По принципу фракционирования различают:

Гель-фильтрацию – молекулы разделяются по размеру. Неподвижная фаза – жидкость, находящаяся внутри гранул (например, силикагеля); подвижная фаза – жидкость, протекающая между ними (чаще всего водно-солевые растворы). Более мелкие молекулы, проникая внутрь гранул через поры, задерживаются там и достигают конца хроматографического пути значительно позже крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь гранул.

Ионообменную хроматографию – молекулы разделяются по заряду. Неподвижная фаза – твердый сорбент (гранулы), подвижная фаза – жидкая. Задержание молекул происходит за счет электростатического взаимодействия между разноименно заряженными ионами на поверхности гранул и молекул компонентов фракционируемой смеси.

Аффинную хроматографию – молекулы разделяются по биологическому сродству, например, между ферментом и его субстратом, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т.д. Один из партнеров такой пары химически закрепляют на матриксе, второй партнер избирательно с ним взаимодействует и таким образом удерживается на колонке. Впоследствии производят промывку и элюцию адсорбированных молекул. Этот метод отличается чрезвычайно высокой избирательностью, а следовательно, эффективностью.

Широкое распространение получила высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC, или гель-фильтрация при высоком давлении). В этом методе используются матрицы из специально разработанных кремнийорганических смол (крупнопористые силикагели, покрытые «гликофазой»), которые имеют вид сферических гранул размером 3-10 мкм. Использование гранул таких размеров значительно повышает разрешающую способность гель-фильтрации. Соответственно увеличилось рабочее давление и скорость элюции; при этом весь процесс хроматографии занимает считанные минуты.

Электрофорез. Электрофорез занимает сейчас центральное место среди методов исследования белков и нуклеиновых кислот. Метод позволяет разделять макромолекулы, различающиеся по таким важнейшим параметрам, как размеры (или молекулярная масса), пространственная конфигурация, вторичная структура и электрический заряд, причем эти параметры могут выступать как порознь, так и в совокупности. Электрофорез можно проводить в водном (буферном) растворе, однако, как правило, его проводят в каком-либо пористом (полимерном) носителе: крахмальном, агарозном или полиакриламидном геле и т.д. Характерной особенностью гелей является наличие в них микроскопических пор.

Физический принцип метода заключается в следующем. Гель помещают в камеру (например стеклянную трубку) с буферным раствором. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным электрическим зарядом, величина и знак которого зависят от рН среды. Если через этот раствор начать пропускать электрический ток, то вдоль канала сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине (В/см). Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом мигрируют в направлении от катода к аноду. При этом скорость продвижения макромолекул сквозь поры геля зависит от величины заряда и размеров молекул, что и определяет их разделение. Постепенно исходный препарат, состоявший из различных молекул, разделяется на зоны одинаковых молекул, мигрирующих с одной и той же скоростью. Со временем эти зоны распределяются по длине канала (рис. 1, справа).

В ходе электрофореза зоны растворенных макромолекул остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом в исходный препарат добавляют краситель, молекулы которого несут электрический заряд того же знака, что и фракционируемые макромолекулы, но не взаимодействуют с ними. Краситель тоже передвигается в электрическом поле, но уже в виде окрашенной зоны. Его подбирают таким образом, чтобы скорость миграции наиболее подвижных макромолекул была несколько ниже, чем у молекул красителя. Когда окрашенная зона доходит до конца трубки, электрофорез прекращают.

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) для идентификации нуклеиновых кислот или белков в геле проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связывающегося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндрического ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы разделившихся компонентов исходной смеси белков.

Вместо цилиндрических часто используют гели в виде тонких пластин, заполимеризованные между двумя плоскими стеклами. Такие пластины имеют важное преимущество: на них можно одновременно фракционировать несколько препаратов.

Вместо окрашивания или наряду с ним часто используют методы обнаружения разделенных зон по их радиоактивности. К ним относятся приемы регистрации полос на фотопленке посредством авторадиографии или флюорографии и различные способы счета радиоактивности в геле с помощью жидкостных сцинтилляционных счетчиков. Фракционированием в ПААГ и агарозе не исчерпываются современные методы электрофореза. В качестве «носителей» жидкой фазы широко используют также пленки из ацетата целлюлозы, фильтровальную бумагу, тонкие слои силикагеля, целлюлозы, сефадекса и др. В некоторых случаях, например для разделения низкомолекулярных веществ, эти системы имеют свои преимущества, однако для фракционирования белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов в настоящее время используют почти исключительно гель-электрофорез.