Методы, основанные на использовании специфической метки

Иммунофлуоресценция. Метод основан на применении в качестве метки флуоресцирующих соединений. Метку химически пришивают к антителу или антигену. Это позволяет регистрировать реакцию антиген-антитело с помощью соответствующих приборов и увеличивает чувствительность анализа. Иммунофлуоресцентный метод широко используется для иммунофенотипирования клеток иммунной системы, то есть для определения набора антигенов, представленных на поверхности клетки. Как правило, с этой целью применяют наборы моноклональных антител, направленных против различных антигенов. Если используют меченые моноклональные антитела, то метод называют прямым. Если клетки обрабатывают немечеными моноклональными антителами, а затем флуоресцентно мечеными антителами, направленными против моноклональных антител, то метод называют непрямым.

Иммуноферментный метод. Объединяет возможности иммунологических и биохимических подходов. В качестве метки используются ферменты, химически сшитые с антигеном или антителом. Он шире других методов распространен в диагностической практике. Обладает высокой чувствительностью (десятые доли нанограмма на миллилитр), позволяет анализировать одновременно множество проб, может быть, как качественным, так и количественным методом, легко стандартизуется, не требует большого количества времени. Существует множество различных вариантов иммуноферментного метода. Чаще всего применяется твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Один из компонентов системы «антиген-антитело» сорбируется на твердую фазу, в качестве которой обычно используется полистирол, имеющий 96 лунок объемом 0,2 мл. В каждой лунке планшета проводится отдельная реакция, которая затем может быть отдельно проанализирована.

При анализе антигенов на стенке лунок полистиролового планшета сорбируются антитела против данного антигена, затем добавляется раствор тестируемого антигена и проводится инкубация, в ходе которой происходит взаимодействие «антиген-антитело». После отмывания не-связавшегося материала в лунки планшетов добавляют антитела против того же антигена, сшитые с ферментом. Формируется связанный с твердой фазой комплекс, состоящий из антител, антигена и антител, меченых ферментом. Комплекс напоминает бутерброд, в связи с чем такой вариант иммуноферментного анализа назван сэндвич-методом. Для повышения специфичности метода используют моноклональные антитела, направленные к разным эпитопам антигена.

Реакция «антиген-антитело» проявляется добавлением в отмытую лунку планшета субстрата для фермента. Используются такие субстраты, которые способны менять свою окраску в присутствии фермента. Чаще всего в качестве фермента используется пероксидаза хрена. Она расщепляет перекись водорода на воду и атомарный кислород. Последний окисляет бесцветные фенольные соединения, у которых появляется окраска. В настоящее время в этих целях применяют ортофенилендиамин (ОФД) и тетраметилбензидин (ТМБ). Появление окрашивания свидетельствует о связывании фермента с твердой фазой и, в данном случае, о положительной реакции на антиген. Количество антигена в растворе оценивается по интенсивности окрашивания раствора субстрата.

Существуют конкурентные и неконкурентные методы анализа. Сэндвич-метод (образование комплекса, состоящего из антител, антигена и антител, меченых ферментом) является неконкурентным. В конкурентном варианте определения антигена взамен антител, сшитых с ферментом, одновременно с немеченым добавляется стандартизированный антиген, меченый ферментом. Он конкурирует с немеченым антигеном за связывание с сорбированными антителами. Чем выше концентрация тестируемого (немеченого) антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с твердой фазой. То есть в данном случае снижение интенсивности иммуноферментной реакции будет свидетельствовать о наличии антигена в тестируемом растворе.

Иммуноферментный анализ применяется для определения самых различных антигенов. С его помощью тестируют наличие в крови антител к самым разным возбудителям инфекций, определяют аутоантитела, оценивают содержание вирусных и бактериальных антигенов, белков крови, опухолевых антигенов, гормонов, наркотиков и многое другое. Метод применяется не только в биомедицине и научных исследованиях, но и в сельском хозяйстве, при экологическом мониторинге и так далее.

Радиоиммунный анализ. Обладает наибольшей чувствительностью. Способен выявлять пикограммовые концентрации антигена в миллилитре. Однако т связи с тем, что в качестве метки применяются изотопы, не нашел столь широкого применения, как иммуноферментный метод. Кроме того, выполнение радиоиммунного анализа требует специализированного оборудования и специальных условий, что также осложняет распространение этого метода. Чаще всего при проведении радиоиммунного анализа используют конкурентные методы. Радиоиммунологический анализ в медицине используется для определения кортикостероидных гормонов и некоторых других антигенов.