Рецепторы с тирозинкиназной активностью
Тирозинкиназные (ТК) рецепторы играют ведущую роль в процессах роста, развития и дифференцировки клеток. Их лиганды – факторы роста (GF) иногда называют митогенами, потому что они стимулируют рост клетки и ее прохождение через митоз. В качестве фактора роста могут выступать цитокины, гормоны и эритропоэтин. GF представляют собой полипептиды, состоящие из 50-100 аминокислот. Каждый тип GF связывается с внеклеточным доменом его собственного специфического рецептора и наоборот, не связывается с рецепторами для других факторов роста. Этот экстраклеточный домен рецептора может рассматриваться как карман, в который соответствующий фактор роста "вставляется" как ключ в замок. Тирозинкиназный рецептор состоит из основных доменов: Ø экстраклеточный (наружный) домен участвует в связывании лиганда и получении внешнего сигнала; могут содержать следующие участки аминокислотной последовательности: ü иммуноглобулиноподобные последовательности (Ig-подобные домены) ü домены фибронектина III, богатые цистеином; ü домены, богатые лейцином; ü домены эпидермального фактора роста (EGF-подобные домены) Функциональное значение этих участков неизвестно. Предполагают, что они участвуют в связывании различных лигандов.
Ø трансмембранный домен (20-24 аминокислотных остатков) однократно пронизывает мембрану и соединяет вне- и внутриклеточные домены.
Ø цитоплазматический тирозинкиназный домен (250-400 аминокислотных остатков), который активируется при связывании агониста и определенных конформационных изменениях экстраклеточного домена; этот домен определяет биологический ответ и передает сигнал внутрь клетки.
На основании сходства структурных элементов в настоящее время выделяют 14 различных семейств тирозикиназных рецепторов. Различие между семействами в основном проявляется в структуре их экстраклеточных доменов (рис. 5).
Лиганды рецепторов с тирозинкиназной активностью. При исследовании различных типов клеток, растущих в культуре ткани, было показано, что рецепторы с тирозинкиназной активностью взаимодействуют с полипептидными лигандами, специфически влияющими на рост клеток (пролиферацию). Одним из первых был обнаружен эпидермальный фактор роста (EGF), действующий на эпителиальные клетки, выделенные из слюнных желез мыши. Тромбоцитарные факторы роста (PDGF) были идентифицированы как компоненты плазмы, присутствующие в сыворотке, но отсутствующие в несвернувшейся крови. Позднее было показано, что его высвобождение происходит при активации тромбоцитов во время тромбообразования. Фактор роста нервов (NGF) и фактор роста фибробластов (FGF) стимулируют рост соответствующих типов клеток. Механизм функционирования. Сигнал, воспринимаемый рецепторными тирозинкиназами проходит следующие этапы: Ø активация киназного домена рецептора Ø в результате фосфорилирования тирозиновых остатков в цитоплазматическом отделе рецептора формируется участки связывания для других субстратов Ø рецептор может фосфорилировать связывающиеся с ним белки Ø активированный рецептор инициирует дальнейшую передачу или выключение сигнала Это типичный процесс передачи сигнала через данную группу рецепторов. Передача молекулярного сигнала от лиганда к цитоплазматическому участку рецептора происходит путем димеризации (или олигомеризации) рецепторного комплекса (рис. 6). При таком межмолекулярном взаимодействии киназные домены двух (или более) рецепторных субъединиц соединяются, вызывая автофосфорилирование, а часто и перекрестное фосфорилирование основных тирозиновых остатков. Фосфорилирование изменяет конформацию рецептора, что обеспечивает стыковку цитоплазматических белков, содержащих специальные домены, с фосфорилированным тирозином рецептора. Такие фосфорилированные белки активируют другие компоненты, принимающие участие в первом этапе сигнального процесса.
Основной механизм передачи сигнала от трозинкиназных рецепторов вовлекает связанные с мембраной Ras-белки. Кроме Ras-белков, рецепторы с тирозинкиназной активностью активируют другие молекулы-мишени – ферменты, промежуточные и структурные белки. SH2 и SH3 домены. Для того чтобы понять значение фосфорилирования тирозиновых остатков, необходимо установить физический механизм, по которому фосфорилированные остатки «притягивают» другие молекулы для взаимодействия с рецептором. Объяснение механизма этого процесса стало важным достижением, подтверждающим особое функциональное значение трехмерной структуры белковых молекул. Трехмерная структура растворимой цитоплазматической тирозинкиназы, называемой Src, позволила выявить субстрат-связывающий домен этого белка, состоящий приблизительно из 100 аминокислотных остатков. Очень похожий участок аминокислотной последовательности имеется во многих белках, взаимодействующих с цитоплазматическим отделом тирозинкиназного рецептора. Этот домен, названный SH2 доменом (Src-homology 2), а также другой домен, названный SH3 (около 60 аминокислот), были изучены с помощью кристаллографических методов. Показано, что они содержат «карман», к которому должен подходить фосфорилированный остаток тирозина. Такой участок имеется практически у всех белков, связывающих фосфорилированные тирозиновые остатки. SH2-и SH3-домены присутствуют в цитоплазматических белках, которые участвуют в тирозинкиназной сигнальной системе (рис. 7).
Промежуточные белки. Одно из первых событий, происходящих в цитоплазме после активации рецептора с тирозинкиназной активностью – это связывание с рецептором особых промежуточных белков. Промежуточные молекулы обычно содержат один или более SH2-доменов и связываются с фосфотирозинами цитоплазматического отдела рецептора. Эти молекулы присоединяют другие цитоплазматические белки к активированному рецептору. Одним из первых был обнаружен промежуточный белок Grb2 – белок массой 24 кДа, содержащий один SH2- и два SНЗ-участка. Grb2 присоединяет к рецептору белок, обменивающий нуклеотиды. Образовавшийся комплекс оказывает стимулирующее влияние на Ras-белок (рис. 8), который запускает другие сигнальные процессы, рассмотренные ниже. Сигнальный механизм Ras-белка. Основным ферментом тирозинкиназного каскада является Ras-белок – небольшая (21 кДа), связанная с мембраной GTP-aзa. Ras относится к группе мономерных GTPaз, которые играют роль «молекулярных преключателей». Ras особенно примечателен тем, что он активирует молекулы, влияющие на клеточную пролиферацию (см. рис.8).
Ras может находиться в активном состоянии, контактируя с GTP, и в неактивном – контактируя с GDP. Активация и инактивация Ras обеспечиваются двумя специфическими белками: Ø фактором, обменивающим гуаниннуклеотиды (guani-nenucleotide exchange factor, GEF), вызывает замену GDP на GTP в Ras-белке, в результате чего, Ras-белок переходит из неактивного состояния в активное. Ø Ras взаимодействует с белком, повышающим GТРазную активность (GTPase-ac-celerating protein, GAP), что приводит к его инактивации.
GEF, активирующий Ras в тирозинкиназном сигнальном каскаде, называется SOS-белком. Это название возникло, когда при исследовании развития глаза у дрозофилы было установлено, что GEF необходим для развития нервных клеток сетчатки. Мутация, приводящая к дефициту этого фактора, была названа son of sevenless, сокращенно SOS. Этот белок активируется при связывании с промежуточным Grb2-белком. В активном состоянии SOS вызывает замену связанного с Ras-белком GDP на GTP. Последний запускает киназный каскад, изменяющий экспрессию генов, особенно тех, которые стимулируют клеточное деление.
Этапы сигнального каскада, приводящие к активации Ras: Ø фактор роста связывается с тирозинкиназным рецептором Ø димеризация рецептора и автофосфорилирование рецепторных остатков тирозина SH2-домен Grb2-белка связывается с фосфорилированным тирозином Ø связывание вызывает конформационные изменения Grb2-белка и его SH3-домен связывается с SOS Ø SOS взаимодействует с мембраносвязанным Ras-белком, превращая GDP в GТP и активируя таким образом Ras. После активации Ras в каскад включаются другие внутриклеточные киназы.
Таким образом, связывание лиганда приводит к тому, что обе половинки рецептора фосфорилируют и активируют друг друга. Как только они активируются, они переходят к фосфорилированию множества близлежащих цитоплазматических субстратных белков, которые затем передают сигнал далее в клетку. После связывания лиганда многие рецепторы путем эндоцитоза убираются внутрь клетки (интернализуются в эндосомы) Вначале на поверхности мембраны происходит образование окаймленных ямок, которые продолжают впячиваться внутрь клетки и превращаются в окаймленные пузырьки. Потеряв окаймляющий чехол, эти пузырьки сливаются с другими, образуя промежуточные пузырьки с гладкой поверхностью, называемыми эндосомами, которые в свою очередь сливаются с лизосомами. Биологическое значение процесса интернализации EGF-рецепторных комплексов в литературе трактуется неоднозначно. Некоторые авторы рассматривают его как простой механизм десенситезации клетки по отношению к действующему фактору. Однако результаты всесторонних исследований функционального состояния интернализованного рецептора противоречат этой концепции. К настоящему времени получены морфологические и биохимические доказательства того, что интернализованный рецептор EGF сохраняет свою связь с лигандом вплоть до попадания в лизозомы.
|
