Занятие № 11.

 

ТЕМА. МИКРОСОМАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ.

КОМПОНЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ. ОПРЕ-

ДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ.

 

Цель занятия: 1.Получить представления об особенностях микросомального окисления, компонентах монооксигеназной цепи, биологическом значении гидроксилирования субстратов, антиоксидантах.

2.Овладеть методикой определения фермента каталазы.

Исходный уровень знаний:

- анаболизм и катаболизм как две стороны единого процесса

обмена веществ;

- представления о окислительном фосфорилировании;

- строение клетки, микросомы;

- оксидоредуктазы.

Содержание занятия.

I.2. Состав микросомной фракции, выделяемой из клеток.

Особенности строения монооксигеназ (гидроксилаз).

Роль микросомального окисления в метаболизме регуляторных молекул, ксенобиотиков.

Антиоксидантная роль витаминов С и Е.

Понятие о пероксисомальном окислении.

Роль пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы.

 

II.1.Работа № 1. КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА КАТАЛАЗУ

Фермент каталаза относится к классу оксидоредуктаз. Этот фермент содержится во всех тканях и жидкостях организма, но особенно много его в строме эритроцитов и печени. Биологическая роль каталазы заключается в разложении вредной для организма перекиси водорода на молекулярный кислород и воду.

 

2H₂O₂ 2H₂O + O₂

каталаза

Принцип метода.

Фермент каталаза содержит гем. В процессе разрушения перекиси водорода происходит окисление и восстановление железа, входящего в состав фермента.

Порядок выполнения работы:

 

Реактивы	Контрольная пробирка	Опытная пробирка
Н2О (мл)
Кровь (кап)
Кипятить 2-3 мин, затем охладить
3% раствор Н2О2 (кап)	5-10	5-10
Встряхнуть
РЕЗУЛЬТАТЫ:

 

Работа № 2.КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

КАТАЛАЗЫ (ПО БАХУ И ЗУБКОВОЙ).

Принцип метода. В основе количественного определения каталазы лежит определение количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток времени, по следующему уравнению:

 

2KMnO₄+5H₂O₂+4H₂SO₄ 2MnSO₄+8H₂O+5O₂+2KHSO₄

 

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа. Каталазным числом (КЧ) называют количество миллиграммов Н₂О₂, которое разлагается в 1 мкл крови. О количестве расщепленной Н₂О₂ судят по разности объема раствора KMnO₄, израсходованного до и после действия каталазы.

Порядок выполнения работы:

Приготовление раствора крови. В мерную колбу вместимостью 100 мл налить около 10 мл дистиллированной Н₂О, затем внести микропипеткой 0,1 мл крови. Микропипетку промыть три раза водой из колбы. Долить водой до метки, чтобы кровь была разведена в 1000 раз (1 мл раствора содержит 1 мкл крови)

 

Реактивы (мл)	Опытная колба	Контрольная колба
Н2О
Кровь, разведенная 1:1000
1% раствор Н2О2		-
10% раствор Н2SO4	-
Примечание. Действие каталазы прекращается в кислой среде, т.к. она действует при рН 7,4 Инкубация 30 минут при комнатной температуре
10% раствор H2SO4		-
1% раствор Н2О2	-

 

Титрование 0,1 N раствором KMnO₄ до розовой окраски.

 

КЧ = (А - В) ∙ 1,7

 

где: А - количество мл 0,1 N р-ра KMnO₄, пошедшее на титрование контрольной пробы;

В - количество мл 0,1 N р-ра KMnO₄, пошедшее на титрование опытной пробы.

Полученную разность умножают на 1,7 (1 мл 0,1 N раствора KMnO₄ эквивалентен 1 мл 0,1 N Н₂О₂, в котором содержится 1,7 ммоль/л (1,7 мг) Н₂О₂, т.к. 1 моль/л Н₂О₂ равен 1,7 г.)

Клинико-диагностическое значение.

В норме каталазное число составляет 10-15 ед. При раке, анемии, туберкулезе содержание каталазы в крови снижается.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ:	А =	В =
КЧ =

ВЫВОД:

 

III.2. Контрольные вопросы.

К какому классу ферментов относятся каталаза и пероксидаза?

В каких клетках наибольшее количество каталазы?

Какой субстрат является специфическим для каталазы?

Что такое каталазное число?

Чему в норме равно каталазное число?

Укажите диагностическое значение количественного определения каталазы крови.

 

Материал для самоподготовки: I а)1. с.313–318, 559

595-596; II; III.