В ТКАНЯХ ОРГАНОВ
ПРИНЦИП РАБОТЫ: В основе спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, разработанного А.С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм.
РЕАКТИВЫ и ОБОРУДОВАНИЕ: 1) НСlО4, 0,2 н. и 0,5 н. растворы; 2) пробирки обычные, мерные и центрифужные; 3) водяная баня; 4) центрифуга с холодильником; 5) СФ-46. ХОД РАБОТЫ: 1. 100-200 мг измельченной на холоду ткани помещают в центрифужную пробирку с 5-10 мл охлажденного 0,2 н. раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин при охлаждении. 2. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок повторно отмывают хлорной кислотой (такая обработка необходима для удаления кислото-растворимых нуклеотидов): к осадку добавляют 5-10 мл0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин. Эта процедура необходима для количественной экстракции нуклеиновых кислот из исследуемой ткани и кислотного гидролиза. 3. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. 4. Надосадочную жидкость сливают в отдельную чистую пробирку. 5. Осадок подвергают повторной экстракции 0,5 н. раствором хлорной кислоты: к осадку добавляют 5-10 мл0,5 н. раствора хлорной кислоты и, закрыв пробирки пробками с воздушными холодильниками, нагревают их на кипящей водяной бане 30 мин. 6. Гидролизаты охлаждают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. 7. Надосадочную жидкость сливают в отдельную чистую пробирку и объединяют с полученной в п.4. Точно измеряют общий объем. 8. Определяют поглощение на спектрофотометре при 270 и 290 нм против 0,5 н. раствора хлорной кислоты. При необходимости исследуемый раствор разводят 0,5 н. раствором хлорной кислоты. 9. Рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора по формуле: Сфосфора = А270 - А290 /0,19 (мкг), где 0,19 - значение Δ А (А270 – А290), которое имеет гидролизат нуклеиновых кислот, содержащий 1 мкг нуклеинового фосфора в 1 мл раствора. При дальнейших расчетах учитывают общий объем гидролизата и разведения. 10. Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются пересчетным коэффициентом 10,3: Снк = Сфосфора ∙ 10,3 (мкг). 11. Рассчитывают содержание нуклеиновых кислот в 1 г исследуемой ткани.
РЕЗУЛЬТАТЫ и ВЫВОДЫ:
Работа №5
|