Метод Сангера и Коулсона (энзиматический метод)В его основе лежит принцип копирования анализируемой цепи ДНК с помощью ДНК полимеразы. Если врастущую цепь ДНК включается дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывается, потому что в 3’-положении отсутствует гидроксильная группа. Если включается дезоксинуклеотид в растущую цепь ДНК, то синтез ДНК может быть продолжен Образец ДНК разделяют на четыре порции Во все порции добавляют: -ДНК-полимеразу -дНТФ (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ) -затравку – олигонуклеотид, комплементарный анализируемой цепи ДНК В первую порцию добавляют ддАТФ, во вторую – ддТТФ, в третью – ддЦТФ, в четвертую – ддТТФ 1 проба: -ДНК- полимераза будет включать в растущую цепь нуклеотиды в соответствии с принципом комплементарности -Напротив Т она может включить либо дАМФ, либо ддАМФ. Процесс включение является вероятностным -Если в растущую цепь ДНК включится ддАМФ, то синтез ДНК оборвется, если в растущую цепь ДНК включится дАМФ, то синтез ДНК будет продолжен. С помощью электрофореза определяют длину фрагментов ДНК. Если длина фрагментов ДНК равна 13, 18 и 23 нуклеотидам, следовательно в 13, 18 и 23 положении фрагмента будет находится А, а в анализируемой цепи Т. Аналогично определяют положение других нуклеотидов в анализируемой цепи ДНК.
43. Полимеразная цепная реакция Суть - многократное копированиеопределенного участка ДНК. В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Стадии ПЦР-анализа 1. Подготовка пробы 2. Амплификация 3. Детекция посредством электрофореза в агарозном геле Компоненты реакционной смеси ПЦР -Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды (15-30 п.н.) идентичные концевым участкам ДНК-мишени, способные с ними образовывать гибриды -Tag-полимераза – термостабильная ДНК-полимераза дНТФ -Анализируемый образец Режим эксперимента 1. Денатурация – реакционную смесь нагревают до 92-95 оС, в результате двухцепочечная ДНК расплетается 2. Отжиг – праймеры присоединяются к одноцепочечным ДНК 3. Элонгация – Tag-полимераза обеспечивает синтез второй цепи ДНК Цикл повторяется 30-35 раз
|
