ДНК-полимеразаВпервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из E.coli. ДНК-полимераза I E.coli (Pol I) связывается с одноцепочечными участками двойной спирали ДНК, в местах одноцепочечных разрывов с З'-гидроксилом и 5'-фосфатом, а также с концами двухцепочечных молекул ДНК. Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 103 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5’→3’ полимеразной, 3’→5’ экзонуклезной, 5’→3’ экзонуклеазной (рис. 7).
Рис. 7. ДНК-полимераза I E. coli: А) структура, Б) модель взаимодействия с молекулой ДНК 1. 5'→3' полимеразная активность. Для реакции необходимо наличие одноцепочечной ДНК-матрицы и комплементарного участку этой цепи фрагмента — праймера (затравки) с З'-ОН концом (рис. 8).
Рис. 8. Схема, демонстрирующая 5'→3' полимеразную активность ДНК-полимеразы I E.coli
2. 3'→5' экзонуклеазная активность. Гидролизует одноцепочечную или двухцепочечную ДНК с З'-ОН конца. 3'→5' нуклеаза расщепляет диэфирную связь только в неспаренных участках ДНК (рис. 9). Известно, что при полимеразной реакции с определенной частотой возможно включение в растущую цепь некомплементарного нуклеотида. Однако полимераза не может присоединять нуклеотид к неправильно спаренному концу, образовавшемуся при ее участии. На помощь приходит 3'→5' экзонуклеаза, убирающая ошибочный нуклеотид, на место которого затем присоединяется правильный нуклеотид-предшественник. рассматриваемая 3'→5' экзонуклеолитическая активность проявляется в направлении, обратном синтезу ДНК (5'→3'). Таким образом, 3'→5' экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы играет важную роль в точности полимеризации, направляемой матрицей. Эффективность, или число оборотов, данной экзонуклеазы в оптимальных условиях составляет 2% от числа оборотов субъединицы с полимеразной активностью.
Рис. 9. Схема, демонстрирующая 3'→5'-экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы I E. 3. 5'→3' экзонуклеазная активность гидролизует одну цепь двухцепочечной ДНК, начиная со свободного 5'-конца. В отличие от 3'→5' экзонуклеазы 5'→3' экзонуклеаза расщепляет диэфирную связь только в спаренных участках двухцепочечной молекулы ДНК. Более того, в то время как 3'→5' нуклеаза отщепляет за одну реакцию только один нуклеотид, 5'→3' нуклеаза может вырезать с 5'- конца олигонуклеотиды длиной до десяти остатков. Скорость нуклеазного отщепления увеличивается на порядок при одновременно протекающей реакции полимеризации. При этом увеличивается относительное количество олигонуклеотидов в продуктах гидролиза ДНК. Такое сочетание ферментативных активностей позволяет ДНК-полимеразе I E. coli играть активную роль не только при репликации запаздывающей нити ДНК, но и в репарации повреждений ДНК in vivo. N - концевой домен ДНК-полимеразы I соединен с соседним участком молекулы петлей из аминокислотных остатков, которая расщепляется протеолитическим ферментом. Оставшаяся часть бифункциональна, так как состоит из полимеразы и 3’→5’ экзонуклезы. Она названа фрагментом Кленова (по фамилии одного из авторов, описавших ее). Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение при исследовании природных ДНК, а также при создании рекомбинантных структур методами генетической инженерии: · достраивание одноцепочечных 5'-концов на двухцепочечной ДНК, часто генерируемых эндонуклеазами рестрикции, до тупых (рис. 9); · синтез второй цепи на одноцепочечной ДНК (рис. 8); · гидролиз одноцепочечных З'-концов на двухцепочечных молекулах ДНК (рис. 9); · получение меченых ДНК-зондов (метод ник-трансляции) с высокой удельной активностью (рис. 10).
Рис. 10. Схема осуществления ник-трансляции с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli При методе ник-трансляции ДНК-полимераза I, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградацию цепи ДНК в 5'→3' направлении, начиная с 5'-конца одноцепочечной бреши (ника) в двухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путем последовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной 3'-гидроксильной группе на другом конце бреши. На самом деле происходит перемещение бреши, которое получило название ник-трансляции.
|
