Лигирование фрагментов с разноименными липкими, или липким и тупым концами

В ситуациях, когда необходимо сшить фрагменты ДНК, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, или тупой и липкий концы применяют адаптеры (to adapt – переделывать) или линкеры (to link – связывать). Это молекулярные "переходники". Адаптер представляет собой синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким (рис. 16). После пришивания адаптера тупым концом к фрагменту ДНК на конце последнего появляется липкий конец для сшивания с комплементарным ему концом другого фрагмента. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

Синтезированы большие наборы таких генных "переходников". Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, нуклеотидные последовательности промотора или последовательности, соответствующие участку связания с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры "тупой конец - липкий конец", “липкий – липкий” и “липкий – тупой” (рис. 16).

 

 

Рис. 16. Изменение концов фрагментов ДНК с помощью различных адаптеров: “тупой – липкий” (1); “липкий – липкий” (2); “липкий – тупой” (3).

 

 

При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента - эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы "застраивают", то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить (рис.17)

 

 

Рис. 17. Преобразование липких концов рестрикционных фрагментов ДНК в тупые.

 

Линкеры, содержащие участки узнавания для нескольких эндонуклеаз рестрикции, называются полилинкерами или множественными сайтами клонирования (MCS – multiply cloning sites). Они будут рассмотрены в следующей главе.