ПЦР в реальном времени.

В настоящее время широкое распространение в исследовательских и диагностических лабораториях получила новая технология ПЦР — ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов (рис. 45)

 

 

Рис. 45. Кинетическая кривая ПЦР в координатах

1. Стадию инициации (когда ПЦР-продукты еще не

детектируется флуоресцентной меткой).

2. Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается

экспоненциальная зависимость количества

флуоресценции от цикла ПЦР).

3. Плато – стадию насыщения.

 

Real-time PCR - это семейство методик количественного ПЦР со следующими чертами:

· определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации;

· построение по этим данным кинетической кривой ПЦР;

· определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

ПЦР в реальном времени использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее амплификации (рис. 46). Детектируемая прибором флуоресценция, прямо пропорциональна количеству ПЦР-продукта, ее обозначают как - репортерная флуоресценця. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time ПЦР.

Детекция сигнала флуоресценции в ходе реакции позволяет наблюдать процесс накопления продукта во время ПЦР, а не после окончания реакции. Сигнал флуоресценции в ходе ПЦР возрастает пропорционально количеству продукта амплификации. Мониторинг сигнала позволяет построить кинетическую кривую реакции, при этом момент заметного увеличения сигнала и отрыва его от фонового – так называемый пороговый цикл – зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.

 

Рис. 46. Схема, представляющая систему использования флуорфоров при проведении ПЦР в реальном времени

Основные преимущества ПЦР в реальном времени по сравнению с методом анализа по конечной точке:

· количественный анализ специфической ДНК в широком диапазоне концентраций;

· сравнительный количественный анализ нескольких типов ДНК в одной пробирке;

· повышение специфичности реакции за счет использования гибридизационных зондов;

· обнаружение и определение процентного содержания ДНК с измененной последовательностью;

· исключение послеамплификационных манипуляций с продуктом и, как следствие, снижение риска контаминации (загрязнения), экономия времени и сокращение затрат на поддержание ПЦР-лаборатории;

· автоматизация и стандартизация ПЦР-анализа.

Обратная транскрипция, сопряженная с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР)

Метод ОТ-ПЦР (англ. RT-PCR – reverse transcription polymerase chain reaction) представляет собой метод амплификации специфического фрагмента рибонуклеиновой кислоты. Одноцепочечную молекулу РНК превращают в реакции обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) и далее амплифицируют уже одноцепочечную молекулу ДНК, используя традиционный метод ПЦР. Для превращения последовательности РНК в комплементарную ДНК использут фермент обратную транскриптазу (см. раздел Ферменты).

Экспоненциальная амплификация при помощи ОТ-ПЦР является чувствительной методикой, с помощью которой может быть обнаружено малое количество молекул РНК. ОТ-ПЦР широко используется для диагностики генетических заболеваний и полуколичественного определения специфических молекул РНК в клетке или ткани как индикатор экспрессии соответствующих генов.