а б в г

а – заражение на хорион-аллантоисную оболочку; б – заражение в аллантоисную полость; в – заражение в амниотическую полость; г – заражение в желточный мешок.

Рисунок 3 – Методы заражения куриных эмбрионов вируссодержащим материалом

При заражении на хорион-аллантоисную оболочку наиболее пригодны 12-дневные эмбрионы (рисунок 3 а). Яйцо берут в левую руку, изогнутыми ножницами срезая скорлупу несколько выше границы воздушного пространства. Пинцетом осторожно снимают часть подскорлупной оболочки, обнажая лежащую под ней хорион-аллантоисную оболочку. Исследуемый материал наносят на хорион-аллантоисную оболочку в объеме от 0,1 мл до 0,2 мл. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным стеклянным колпачком или покровным стеклом и заливают расплавленным парафином или воском. На боковой поверхности зараженных яиц простым карандашом пишут дату заражения, название материала и его дозу.

Для заражения в аллантоисную полость используют эмбрионы 10-11-дневного возраста (рисунок 3 б). Эмбрион заражают через воздушное пространство 4-х сантиметровой иглой, помещают его тупым концом вверх и копьем делают прокол в дезинфицированной скорлупе над центром воздушного мешка. Через отверстие в скорлупе вводят в вертикальном направлении на глубину примерно 2 см иглу шприца, которая проходит через воздушное пространство, хорион-аллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость. Материал инкубируют в объеме от 0,1 мл до 0,2 мл. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Для заражения в амниотическую полость применяют эмбрионы 7-11-дневного возраста (рисунок 3 в). Заражение следует выполнять в затемненном боксе. Скорлупу над воздушным пространством прокалывают в центре. Яйцо укладывают на овоскоп тупым концом направо и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. При попадании в амниотическую полость наблюдается смещение тени эмбриона. Объем вводимого материала – 0,1 мл. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином.

Для заражения в желточный мешок используют эмбрионы 7-дневного возраста (рисунок 3 г). В скорлупе над воздушным мешком в центре прокалывают отверстие. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный мешок был обращен вверх (сторона яйца, противоположная той, где расположен эмбрион). Через отверстие в скорлупе вводят в горизонтальном направлении на глубину 3 см иглу шприца. Материал вводят в желточный мешок в объеме от 0,2 мл до 0,3 мл. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Зараженные эмбрионы устанавливают на подставках тупым концом вверх. Температурный режим и срок инкубации зависят от биологических свойств инокулированного вируса. Ежедневно жизнеспособность эмбрионов контролируют под овоскопом. Эмбрионы, погибшие в первые сутки после заражения вследствие травмы, не исследуют.

Титрованием вируса называют количественное определение инфекционности исследуемого препарата. Наименьшее количество вируса, способное вызвать у чувствительного хозяина распознаваемое проявление инфекции, называется инфекционной единицей. Титр исходной вирусной суспензии выражается в количестве инфекционных единиц, содержащихся в 1 мл препарата. Чтобы вызвать инфекцию для большинства вирусов, в принципе достаточно одной вирусной частицы. Вместе с тем число инфекционных единиц, выявляемых при титровании, всегда существенно ниже числа физических частиц, подсчитанных, например, с помощью электронного микроскопа. Основные причины этого явления заключаются в том, что часть вирионов в суспензии по тем или иным обстоятельствам не инфекционна и, главное, что любая система для определения инфекционности имеет ограниченную чувствительность. Поэтому получаемая величина титра вируса всегда зависит не только от его количества в исходном препарате, но и от способа выделения вируса, свойств хозяина и т.п.

Как правило, обязательным компонентом титрования является тест, позволяющий оценить результат инокуляции как положительный или отрицательный, например наличие или отсутствие поражений в культуре клеток, характерная реакция или ее отсутствие у животного, гибель или выживание животных, наличие или отсутствие специфических гемагглютининов в аллантоисной полости куриных эмбрионов и т.п.

Наиболее точные результаты при титровании вирусов животных дают методы, в основе которых лежит подсчет числа дискретных поражений, в частности бляшек, при заражении культуры тканей. Некоторые вирусы, например вирус гриппа, сложно оттитровать методом бляшек, в этом случае инфекционность препарата оценивают при помощи титрования по методу конечных разведений.

Согласно этому методу, чувствительным хозяевам вводят определенный объем суспензии вируса в последовательно возрастающих разведениях и, учитывая результат каждого введения как положительный или отрицательный, рассчитывают конечную точку титрования. В случае вируса гриппа результат оценивают как положительный, если через 48 ч после заражения жидкость эмбрионов будет вызывать агглютинацию куриных эритроцитов.

При проведении титрования подобного типа наблюдается зона, в которой одно разведение может дать отрицательный результат, а следующее, большее – положительный, что объясняется случайным характером распределения вирусных частиц.