Получения моноклональных антител

При введении антигена в организм возникает большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам и различающихся даже внутри группы антител, направленных к одной и той же детерминанте. Однако иногда требуется определённый вид антител, специфичных лишь к одной детерминанте антигена и имеющих одни и те же характеристики.

Моноклональные антитела – это антитела строго определённой специфичности, продукт одного клона. Моноклональные антитела гомогенны как по специфичности, так и по физико-химическим свойствам. В природе почти никогда не наблюдается истинный моноклональный ответ.

Получение моноклональных антител стало возможным благодаря работам Георга Келера и Цезаря Мильштейна, которые в 1984 г. стали лауретами Нобелевской премии. Они применили оригинальный подход, получив гибрид нормальной антителообразующей клетки (АОК) и опухолевой клетки (гибридому). Гибридома наследовала от нормальной клетки способность к синтезу антител, а от опухолевой клетки – способность к неограниченному числу делений (бессмертие).

Для получения гибридом наиболее подходящими оказались клетки плазмоциты, опухоли, происходящей из плазматических клеток. Эти клетки по своей дифференцировке наиболее соответствовали антителообразующим клеткам, так как сохраняли способность к синтезу иммуноглобулинов. С использованием специальных приемов были получены мутантные плазмоцитомные клетки, не способныесинтезировать нуклеиновые кислоты по резервному пути из гипо­ксантина и тимидина.

Для получения АОК животных (мышей или крыс) активно иммунизировали определенным антигеном. Когда продукция антител достигала высокого уровня, из селезенки и лимфоузлов животных (мест скопления АОК) готовили суспензию клеток.

Затем вызывали слияние АОК с клетками плазмоцитомы, применяя для этой цели полиэтиленгликоль (ПЭГ) – полиэлектролит, способствующий слиянию клеточных мембран. Гибридома сохраняла способность к клеточному делению, в процессе которого хромосомы обоих ядер перемешивались и образовывали одно общее ядро, содержащее гены иммуноглобулинов обеих клеток – предшественников.

Для того чтобы отделить заданную гибридому от присутствующих в системе отдельных неслившихся клеток и от гибридов иного состава или иной специфичности, чем требуемые, авторы разработали специальную схему, использующую отбор клеток в селектирующей ГАТ-среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Аминоптерин является высокотоксичным агентом, блокирующим синтез пуриновых оснований, необходимых для дальнейшего синтеза нуклеиновых кислот. Это приводит к гибели опухолевых клеток, имеющих метаболический дефект, не позволяющий использовать резервный путь синтеза пуриновых оснований. АОК способны расти в ГАТ-среде, но будучи смертными погибают естественным путем через 1 – 2 недели. Гибридомы же сохраняют жизнеспособность, поскольку сочетают свойства «бессмертной» опухолевой клетки и АОК, использующих обходной метаболический путь синтеза пуринов.

Выжившие в ГАТ-среде гибридомные клетки рассеивают в пластиковые планшеты на 96 лунок ёмкостью 0, 2 см³ (в каждую по 10 гибридом), через несколько дней содержимое лунок проверяют на наличие антител нужной специфичности (т. е. моноклональных). Клетки из лунок, содержащих таковые, клонировали, рассеивая по 1 клетке в лунку. Эта клетка-предшественник дает начало формированию «бессмертного» клона, продуцирующего моноклональные антитела. Процедура повторяется до 2 раз.

Полученные клоны гибридомных клеток можно хранить длительное время при -70 ^оС, как угодно долго культивировать на питательных средах, накапливая антитела, перевивать от одного подопытного животного другому. Секретируемые этими клетками антитела не содержат посторонних антител, физико-химически однородны и могут рассматриваться как чистые химические реактивы.

Следует отметить альтруизм создателей гибридомной технологии. В интересах развития науки Г. Келер и Ц. Мильштейн отказались от патентования своего метода, более того предоставили клеточную линию плазмоцитомы для исследования во все ведущие исследовательские лаборатории в мире.

В настоящее время гибридомная технология лежит в основе получения абзимов, о чем говорилось выше. Моноклональные антитела в силу своей высочайшей специфичности, стандартности и технологичности широко применяются как диагностикумы для определения широкого спектра биологически активных веществ: белков, гормонов, медиаторов воспаления, бактериальных и вирусных антигенов, различных ядов.

 

Рис. 31. Получение моноклональных антител

 

Моноклональные антитела широко используются в онкологии, с их помощью доставляются радиоактивные метки в опухоли и их метастазы, что позволяет по локализации радиоактивности обнаружить даже небольшие скопления опухолевых клеток. Сейчас во всем мире активно ведутся исследования по применению моноклональных антител как переносчиков токсических веществ в места локализации опухолей.