Определение активности протеолитических ферментов

 

Н | R1–С–N–R2 + H2O ® R1–C–ОН + R2–NH2 ‖ ‖ О О

Протеолитические ферменты (3, 4), или протеазы, катализируют гидролиз пептидных связей в молекулах белков и пептидов по схеме:

 

 

(R₁ и R₂ – полипептидные цепи белков или пептидов)

 

Протеазы подразделяют на протеиназы и пептидазы. Протеиназы катализируют гидролитическое расщепление пептидных связей в молекулах белков, а пептидазы действуют только на пептиды. Из протеиназ наиболее хорошо изучены строение и свойства пепсина (3.4.23.1), трипсина (3.4.21.4), химотрипсина (3.4.21.1) и папаина (3.4.22.2).

Пепсин выделяется слизистой оболочкой желудка в виде неактивного белка пепсиногена, который активируется в кислой среде в результате частичного гидролиза определённых пептидных связей. Этот фермент преимущественно расщепляет пептидные связи, соединяющие какой-либо аминокислотный остаток с остатком ароматических аминокислот. В каталитическом действии пепсина важную роль играют карбоксильные группы дикарбоновых аминокислот. В каталитическом действии трипсина и химотрипсина участвуют аминокислотные остатки серина, гистидина, аспарагиновой и глутаминовой кислот. Выяснено, что трипсин направленно катализирует гидролиз пептидных связей, которые образованы с участием аминокислотных остатков аргинина и лизина. В результате действия пепсина, трипсина и химотрипсина белки гидролизуются с образованием пептидов и свободных аминокислот. Эти ферменты получены в кристаллическом виде и определены их аминокислотные последователь-ности.

К протеиназам также относится растительный фермент папаин, выделенный из млечного сока дынного дерева. В молекуле папаина содержится 212 аминокислотных остатков, которые при формировании третичной структуры образуют три дисульфидные связи. В гидролитической реакции, которую катализирует папаин, участвуют сульфгидрильная группа (− SH) цистеина и амидазольная группировка гистидина.

В растениях различают два вида протеиназ, одни из них содержат в активном центре сульфгидрильную группу (НS-группу) и поэтому их называют тиоловыми протеиназами. Другие растительные протеиназы не содержат в активном центре тиоловых группировок и они по строению каталитического центра имеют сходство с протеиназами животного происхождения – пепсином и трипсином.

Характерное свойство тиоловых протеиназ – их способность акти-вироваться цианидами и сульфгидрильными соединениями, содержащими НS-группы (цистеин, восстановленный глютатион и др.). Указанные соединения переводят окисленную форму фермента в восстановленную, которая и обладает гидролитической активностью. Схематически процесс восстановления тиоловых протеиназ можно представить следующим образом:

+2Н Ф-S-S-Ф ¾ ¾ ® Ф-SH + Ф-SH ¾ ¾ -2Н восстановленная окисленная восстановленная форма форма

 

 

Под действием окислителей фермент переходит в окисленную дисульфид-ную форму.

В растениях, кроме папаина, типичными представителями этих ферментов являются бромелаин, полученный из плодов и стеблей ананаса; фицин, содержащийся в млечном соке фигового дерева. В листьях многих растений найдены протеиназы, активируемые сульфгидрильными соедине-ниями. К тиоловым протеиназам также относятся многие протеолитические ферменты, выделяемые из пшеничного солода. Из семян и плодов многих растений выделены также нетиоловые протеиназы. К ним относятся арвенсин из семян гороха; арахаин, содержащийся в семенах арахиса; соланаин, выде-ленный из плодов паслёна. К этой же группе ферментов относятся протее-иназы многих грибов.

Пептидазы включают три группы ферментов: аминопептидазы, катали-зирующие гидролитическое отщепление аминокислотных остатков от N-концов пептидов; карбоксипептидазы, катализирующие гидролитическое отщепление аминокислотных остатков от С-концов пептидов; дипептидазы, катализирующие гидролиз пептидных связей в дипептидах с образованием свободных аминокислот.

O карбокси- O ‖ пептидаза ‖ R–C–N–CH–COOH + H2O ¾ ® R–C–ОН + Rn–CH–COOH | | | Н Rn NH2 полипептид С-концевая α -аминокислота

К пептидазам, отщепляющим аминокислотные остатки от С-конца полипептидных цепей, относится карбоксипептидаза А (3.4.17.1), которая синтезируется в поджелудочной железе животных. Этот фермент содержит в активном центре Zn²⁺, образующий хелатные связи с двумя имидазольными группами гистидина и карбоксильной группой глутаминовой кислоты. В каталитическом действии карбоксипептидазы А также участвуют аминокис-лотные остатки аргинина и тирозина.

 

 

Типичным представителем аминопептидаз является лейцинаминопеп-тидаза (3.4.11.1), катализирующая гидролитическое отщепление от N- концов полипептидов остатков лейцина:

О О ‖ ‖ H2N–CH–C–N–R + H2O ¾ ® H2N–CH–C–ОН + H2N–R | | | CH2 H CH2 | | CH CH / \ / \ H3C CH3 H3C CH3 пептид лейцин

 

 

O ‖ H2N–CH2–C–N–CH2–COOH + H2O ¾ ® 2H2N–CH2–COOH | H глицин глицилглицин

К дипептидазам относится фермент глицилглицинпептидаза (3.4.13.11), атализирующая гидролиз дипептида глицилглицина:

Фермент пролиназа (3.4.13.8) расщепляет дипептиды, у которых в образовании пептидной связи участвует карбоксильная группа пролина.

Пептидазы в большинстве своём металлосодержащие ферменты, которые могут проявлять каталитическую активность при различных условиях физиологической среды в клетках растений и других организмов. При совместном действии всего комплекса протеолитических ферментов белки гидролизуются до свободных аминокислот.

Сведения об активности протеолитических ферментов имеют важное практическое значение. Особенно они важны при оценке качества продукции зерновых культур. На ранних стадиях созревания зерновок злаковых культур в них наблюдается высокая активность протеолитических ферментов. Однако при созревании в зерновках усиливается синтез белков – эндогенных ингибиторов протеаз, которые связывают ферментные белки в неактивные комплексы, в результате чего к моменту полного созревания зерна в нём почти не обнаруживается протеолитическая активность. Связывание протеаз в неактивные комплексы может также осуществляться запасными белками зерна и мембранными структурами клеток.

Однако при влажных условиях во время созревания зерна ослабляется синтез запасных белков и белков – ингибиторов протеаз, вследствие чего к концу созревания в зерновках остаётся повышенная протеазная активность. И если такое зерно используется для приготовления хлеба, то в процессе формирования хлебопекарного теста под действием протеолитических ферментов происходит значительная деградация молекул запасных белков, что приводит к ослаблению клейковинного комплекса. В результате понижается газоудерживающая способность и усиливается разжижение теста, вследствие чего снижается качество выпекаемого хлеба. При использовании зерна с повышенной протеазной активностью для производ-ства макарон и крупы также наблюдается ухудшение качества этих продуктов вследствие ослабления комплекса их клейковинных белков.

При поражении зерна клопом-черепашкой ухудшение его качества происходит в результате того, что эти насекомые вводят в созревающие зерновки активный комплекс протеолитических ферментов, вызывающих деградацию белков зерна, и прежде всего клейковинных белков. От действия протеолитических ферментов в значительной степени зависит и качество солода, которое получают из проросшего зерна.

При определении активности протеолитических ферментов учитывают количество гидролизованного субстрата (белков) или образующихся продуктов гидролиза (свободных аминокислот). Для оценки суммарной активности протеолитических ферментов очень часто используется метод, разработанный Ансоном.

Принцип метода. По методу Ансона активность протеаз оценивают по количеству аминокислоты тирозина, образующейся, как и другие протеиногенные аминокислоты, в процессе гидролиза белков под действием этих ферментов. Концентрацию тирозина определяют колориметрическим методом с использованием реактива Фолина или спектрофотометрически при длине волны 280 нм.

Оборудование. Фарфоровые ступки с пестиками диаметром 8-10 см; лабораторные весы; марля для фильтрования; фарфоровые чашки диаметром 6-8 см; дозирующие пипетки на 1-10 мл; конические колбы на 50 мл; воронки диаметром 5-6 см; бумажные фильтры; мерный цилиндр на 25 мл; стеклянные пробирки на 20 мл в штативах; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр с набором кювет; термостат, мерные колбы на 100, 500, 1000 мл; тёмная склянка на 150 мл.

Реактивы. Химически чистый альбумин; 0, 05 М фосфатный буфер с рН=8, 0; трихлоруксусная кислота (ТХУ); карбонат натрия; реактив Фолина; дистиллированная вода (свободная от диоксида углерода).

Приготовление растворов. 0, 05 М фосфатный буфер (рН=8, 0): в 1 л дистиллированной воды растворяют 17, 911 г Na₂ HPO₄ ∙ 12Н₂ О; в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0, 780 г NaН₂ РО₄ ∙ 2Н₂ О. Затем 53 мл раствора NaН₂ РО₄ ∙ 2Н₂ О смешивают с 947 мл раствора Na₂ HPO₄ ∙ 12Н₂ О.

0, 5% раствор альбумина: 0, 5 г чистого белка альбумина растворяют раствором 0, 05 М фосфатного буфера в мерной колбе на 100 мл.

14% раствор ТХУ: 70 г ТХУ растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 500 мл.

0, 5 М карбонат натрия: 52, 995 г Na₂ CO₃ растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 1 л.

Раствор реактива Фолина: 10 мл реактива Фолина разбавляют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл, объём раствора в колбе доводят до метки, перемешивают и переливают в тёмную склянку.

Ход определения. На лабораторных весах взвешивают навеску проросших семян 2 г (злаковых, зернобобовых, масличных и других растений) с точностью до 0, 01 г и растирают в ступке с небольшим количеством кварцевого песка до получения однородной массы. Затем в ступку приливают 20 мл дистиллированной воды и смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут, после чего ферментный экстракт отжимают через 4 слоя марли в фарфоровую чашку и далее используют как источник протеаз для проведения ферментативной реакции.

В 2 конические колбы на 50 мл дозирующей пипеткой приливают по 4 мл 0, 5% раствора альбумина и 4 мл дистиллированной воды, в одну из колб также приливают 10 мл 14% раствора ТХУ для осаждения белков (инактивация ферментов); содержимое пробирок перемешивают и помещают на 15 минут в термостат при температуре 40°С. Затем в обе колбы приливают по 2 мл ферментного раствора, их содержимое перемешивают и фиксируют точное время начала ферментативной реакции, после чего колбы помещают на 30 минут в термостат при указанной выше температуре для проведения ферментативной реакции гидролиза белков альбумина протеазами. По истечении 30 минут во вторую колбу приливают 10 мл 14% раствора ТХУ, содержимое колбы перемешивают и фиксируют точное время прекращения ферментативной реакции, затем полученную смесь оставляют на 15 минут для осаждения белков.

После отстаивания надосадочную жидкость в колбах фильтруют в стеклянные пробирки и в фильтрате определяют содержание тирозина. В 2 стеклянные пробирки вносят по 1, 5 мл фильтрата и 4 мл 0, 5 М раствора карбоната натрия, содержимое пробирок перемешивают и в каждую из них добавляют 0, 8 мл разбавленного раствора реактива Фолина, содержимое пробирок снова перемешивают и через 20 минут колориметрируют на фото-электроколориметре при длине волны 630 нм и толщине фотометрируемого слоя 1 см.

При определении содержания тирозина на спектрофотометре полученный фильтрат наливают в кварцевую кювету спектрофотометра и измеряют оптическую плотность раствора при длине волны 280 нм.

В результате колориметрирования окрашенного раствора или спектрофотометрирования фильтрата получают оптическую плотность раствора с активными протеазами (раствор ТХУ приливали после проведения ферментной реакции) и инактивированными протеазами (раствор ТХУ приливали до проведения ферментной реакции).

Обработка и оценка результатов. Активность протеаз вычисляют по формуле:

(D₁ -D₂) ∙ 20

А = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾,

Н ∙ 2 ∙ t

 

где А – активность протеаз в единицах оптической плотности раствора тирозина, образовавшегося за 1 час под действием этих ферментов в расчёте на 1 г растительной массы;

D₁ – оптическая плотность раствора в варианте с активными протеазами;

D₂ – оптическая плотность раствора в варианте с инактивированными протеазами;

20 – объём ферментного экстракта, выделенного из растительной пробы, мл;

2 – объём ферментного экстракта, взятый для проведения ферментной реакции, мл;

Н – навеска растительного материала, г;

t – время ферментативной реакции в часах.

Полученный результат сравнивают с другими определениями протеазной активности в проросших семенах различных сельскохозяй-ственных культур, а также в семенах при разной длительности проращива-ния. На основе этих данных оценивают качество семян.

Контрольные вопросы

1. Какие существуют группы протеаз и какие они катализируют биохимические реакции?

2. Как действуют на белковые молекулы протеиназы и пептидазы?

3. Каковы особенности растительных протеиназ по строению каталити-ческого центра?

4. Как действуют на пептиды аминопептидазы, карбоксипептидазы и дипептидазы?
5. Как влияют протеолитические ферменты на качество растительной продукции?

6. В чём состоят принципиальные особенности определения активности протеаз по методу Ансона?

7. По какой методике получают ферментный раствор и проводят его реакцию с белковым субстратом при определении протеазной активности?

8. Как проводится колориметрическое или спектрофотометрическое определение тирозина, образовавшегося в результате гидролиза белков под действием протеолитических ферментов?

9. По какому принципу ведётся расчёт активности протеаз и в каких единицах выражается каталитическая активность этих ферментов?

10. Как используются сведения о каталитической активности протеаз при оценке качества растительной продукции?