Студопедия Главная Случайная страница Задать вопрос

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Этапы ДНК-диагностики с использованием полимеразной цепной реакции




1. Получение материала для исследования.Длямолекулярно-генетической диагностики используют любые ядросодержащие клетки. Для диагностики наследственного заболевания чаще берут кровь (лейкоциты), реже смывы из полости рта, волосяные фолликулы. Для пренатальной диагностики проводят хориоцентез (получение ворсинчатой оболочки-хориона). плацентоцентез (получение ткани плаценты), амниоцентез (получение амниотической жидкости и выделение из нее клеток), кордоцентез (получение пуповинной крови). Для судебной медицины любые ткани (пятна крови, кожа, сперма и др.), для установления родства с помощью методов геномной дактилоскопии кровь. Для диагностики инфекционных заболеваний –соскобы из влагалища, уретры, бронхолегочные смывы, культуры возбудителей. Для диагностики онкологических заболеваний - красный костный мозг (при лейкозах) и др.

2. Выделение ДНК.Для исследования методом ПЦР пригодны даже небольшие фрагменты слабоочищенной ДНК. Как правило, ДНК из биологического материала при этом выделяют методами лизиса клеток с последующей очисткой от белковых компонентов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет избирательно амплифицировать (многократно редуплицировать) интересующий исследователя участок ДНК в миллионы раз. Принцип ПЦР основан на амплификации ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы, осуществляющей синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух олигонуклеотидных праймеров (затравок) -прямого и обратного. Праймеры – это фрагменты ДНК, комплементарные противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Таким образом, синтез новой цепи может идти только в одном направлении - начиная с 3'-конца в направлении встречного праймера. Во многом процесс амплификации сходен с редупликацией ДНК в ядре клетки. В реакционной смеси должны присутствовать:

1) матрица - исходная цепь изучаемой ДНК, по образцу которой и происходит синтез новых фрагментов,

2) нуклеотиды - "строительный материал" для наращивания вновь синтезируемых цепей ДНК,

3) фермент ДНК-полимераза, катализирующий процесс синтеза ДНК (в настоящее время используется термостабильная полимераза, выделенная из бактерий горячих источников с оптимумом работы при температуре 72 градуса) и

4) олигонуклеотидные праймеры.

Проведение реакции осуществляется в специальной буферной смеси с определенными концентрациями ионов калия, хлора и точным значением рН.

Смесь ставят в специальный прибор – амплификатор. В нем автоматически происходит смена температур, необходимых для реакции. В результате чего происходит многократная редупликация участка ДНК, который мы хотим выделить. В итоге число копий ДНК увеличивается в миллионы раз.

Полимеразная цепная реакция проходит циклически. Каждый цикл имеет три фазы:

1) Денатурация или плавление – смесь нагревают до 90 –95 градусов. При этом происходит разрыв водородных связей, соединяющих две цепи ДНК.

2) Отжиг – смесь охлаждают, праймеры соединяются с комплементарными участками ДНК.

3) Синтез – смесь вновь нагревают до 72 градусов, начинает работать термостабильная ДНК – полимераза и синтезируется дочерняя цепь ДНК. ДНК-полимераза достраивает нить нуклеотидов комплементарно матричной ДНК. При этом праймер включается в состав вновь синтезируемого участка нуклеиновой кислоты.

                               
   
         
 
     
 
     
   
 
 
     
         
 
 
     
 

 

 


ДНК 1 фаза 2 фаза 3 фаза

 

праймер

 

С помощью ПЦР можно решать следующие задачи:

1) Амплификация желаемого участка ДНК, даже если анализируемый препарат недостаточно очищен или представляет собой сложную смесь молекул. Именно такими препаратами являются образцы крови, мочи, экссудатов, мокроты и других сред организма, а также бактериальные культуры.

Амплификация ДНК, присутствующей в образце в ничтожно малых количествах. По сути, в качестве стартового материала для ПЦР (как видно из схемы на рис.1) достаточно взять не только одну клетку, но и одну молекулу. Это важно при исследовании проб воздуха, воды и т.д. на наличие патогенных возбудителей заболеваний.

К настоящему времени разработано большое количество разновидностей ПЦР, среди которых практическое значение в ДНК –диагностике имеют:

1. Специфическая ПЦР с парой праймеров, применяемая для идентификации возбудителей заболеваний, диагностики наследственных болезней;

2. ПЦР-генотипирование с праймерами, выявляющими генетическую гетерогенность исследуемых организмов, применяемая в судебной медицине, в диагностике наследственных болезней.

Существуют специальные способы проведения ПЦР, позволяющие изучать не только ДНК, но и РНК. Это важно, например, при исследовании РНК-содержащих вирусов (ретровирусы, в том числе ВИЧ, вирус гепатита С, гриппа А и другие), а также при анализе экспрессии различных генов в организме. Подобные методики обычно включают в себя два этапа: обратную транскрипцию и ПЦР на матрице полученной ДНК.

4. Электрофорез фрагментов в ДНК в геле. В гель добавляют бромистый этидий (краска, которая окрашивает ДНК). Фрагменты ДНК перемещаются на определенное расстояние. Участок геля, в котором будут находиться фрагменты ДНК окрасится краской. Одновременно проводят электрофорез контрольных фрагментов.

5. Анализ полученных результатов. Участки геля, в которых находятся фрагменты ДНК, будут давать оранжевое свечение при ультрафиолетовом освещении Совпадение полос контрольного фрагмента и опытного позволят диагностировать наличие искомого гена. Гель можно сфотографировать или его изображение перенести на экран компьютера.

 






Дата добавления: 2014-11-12; просмотров: 156. Нарушение авторских прав

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2017 год . (0.008 сек.) русская версия | украинская версия