L - длина стороны малого квадратаD - глубина камеры Зачем надо разводить? - Исходная суспензия настолько концентрирована, что если ее не развести раз в 200, то сосчитать клетки невозможно, слишком густо в поле зрения. Для разведения используют или МЕЛАНЖЕР от ГЕМОМЕТРА САЛИ или микродозатор. При работе с камерами их рабочие поверхности должны быть чистыми и сухими. К сухой счетной камере притирают сухое покровное стекло, а потом заполняют капиллярное пространство. Кровь (или суспензию клеток) из пробирки берут или пипеткой или концом стеклянной палочки,: осторожно вносят каплю суспензии в торцевую щель капиллярного пространства. Камеру следует заполнять так, чтобы вся поверхность, на которой нанесена сетка была заполнена жидкостью без затекания ее в бороздки и без пузырьков воздуха. После заполнения оставляют камеру на 1 минуту в покое для оседания форменных элементов. Затем камеру следует положить на столик микроскопа, КОТОРЫЙ ДОЛЖЕН БЫТЬ СТРОГО ГОРИЗОНТАЛЬНЫМ и приступают к подсчету форменных элементов при малом увеличении микроскопа (объектив х8, окуляр х10 или х15). Для лучшей визуализации стоит затемнить поле зрения - закрыть диафрагму или опустить конденсор. В практикуме используется камера, которая сразу вделана в столик микроскопа, а покровное стекло можно не притирать - оно прижимается специальными пружинами. В случаях, когда требуется большая точность, клетки считают на 2 сетках и результат берут среднеарифметический. Клетки считают в 5 больших квадратах (80 малых), расположенных по диагонали. Подсчету подлежат все клетки, лежащие внутри маленького квадрата, и те, которые находятся на левой и верхней линиях его или касаются их с той или другой стороны. Клетки, расположенные на правой и нижней линиях или касающиеся их с обеих сторон не считают, так как они будут сосчитаны в следующем квадрате. Результаты подсчета в каждом большом квадрате откладывают на 11 клавишном счетчике или записывают в столбик и затем суммируют.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КАМЕР Сторона малого квадрата в камере Фукса-Розенталя - 0.25 ± 0.001 мм Сторона большого квадрата - 1.0 ± 0.0015мм Сторона сетки - 4 ± 0.005мм Глубина камеры 0.2 ± 0.0005 мм Сторона малого квадрата в камере Горяева - 0.05 ± 0.001мм Сторона большого квадрата - 0.2 ± 0.0015мм Сторона сетки - 3 ± 0.005мм Глубина камеры - 0.1 ± 0.008мм При соблюдении описанного режиме подсчета и соблюдении метрологических характеристик камеры ошибка достигает 2 - 3% 4.2. СРЕДНИЙ ОБЪЕМ КЛЕТОК В СУСПЕНЗИИ легко определить если известен гематокрит и концентрация клеточных тел.
где - V - средний объем клеток в суспензии [ мм3 ] G - гематокрит Х - концентрация клеточных тел в [кл/мм3 ] Средний размер клеток в "сфероидном приближении" - если известен объем клетки, например эритроцита, то легко найти радиус клетки, особенно полагая ее сферой. Кстати, такое приближение достаточно корректно для эритроцитов в гипотонических условиях - вследствие сферуляции они действительно достаточно шарообразны.
Можно, разумеется произвести определение среднего радиуса клеток в суспензии и другими способами, которые также можно отнести к ПРЯМЫМ. Например, с помощью измерительного микроскопа или интерференционного микроскопа. Однако, в задачи практикума по ОБЩЕЙ БИОФИЗИКЕ как основные задачи, названные методы не входят. Они могут быть выполнены как факультативные. С методами цитометрии студенты ВБ/Ф должны были познакомиться еще на 2 курсе, на кафедре гистологии и цитологии.
4.3. Приготовление рядов разведений суспензий. При приготовлении рядов разведений суспензий следует учитывать: а) все разведенные суспензии следует хранить в пластиковой посуде - иначе концентрация будет падать в процессе хранения, из-за адгезии клеток на стекле; б) Разводить исходные суспензии следует по возможности точнее - ведь концентрация клеток в них будет определена простым пересчетом из исходной концентрации. Вообще-то, лучше бы, в каждом разведении определить отдельно концентрацию с помощью прямого подсчета и сопоставить оба результата: пересчетный и прямой.
[1] Выполняют только студенты подгруппы «биофизика» [2] задание не выполняется, вместо этого считать e = 2 ¸ 4 [3] правильнее сказать «объемный индекс» – объектом могут служить не только эритроциты, но и другие клетки. [4] Желающие могут проверить это экспериментально, на факультативных занятиях.
|
