Лабораторная работа № 2."КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА НЕКОТОРЫЕ ФЕРМЕНТЫ" Качественно ферменты можно обнаружить по их действию на те или иные субстраты. Опыт №1. Определение пепсина. Общие понятия. Пепсин и химозин вырабатываются стенками желудка и катализируют реакцию гидролиза белка до пептонов. Оба фермента действуют в сильно-кислой среде (рН=1,4 – 2,5). Активатором этих ферментов является соляная кислота. Реактивы: пепсин 1% р-р. Исследуемое вещество: молоко (белок молока). Ход работы: В две пробирки наливают по 2 мл молока, затем и первую пробирку добавляют 5 капель пепсина, во вторую пробирку 5 капель предварительно прокипяченного и охлажденного пепсина. Обе пробирки помещают в баню при 37°. Через несколько минут сравниваем содержимое пробирок. Что наблюдаете? Сделайте вывод. Опыт № 2. Реакции на тирозиназу. Общие понятия. Фермент тирозиназа относится к фенолооксидазам. Этот фермент катализирует окисление тирозина и других производных фенолов газообразным кислородом воздуха с образованием красного пигмента галохрома, который затем превращается в темный пигмент, родственный меланинам. Схематично катализируемый процесс можно изобразить следующим образом:
красный пигмент Источником фермента могут быть растительные и животные ткани, например, сырой картофель, мышечная ткань, кровь и т.д. Особенно много тирозина находится ближе к поверхности клубня.
Ход работы: 1 г сырого картофеля измельчают в ступке с 3 мл дистиллированной воды и быстро фильтруют через марлю. Фильтрат содержит тирозиназу. Полученную вытяжку делят на две части. Одну часть кипятят. Затем в обе пробирки добавляют по 5-10 капель 0,1% раствора тирозина и помещают их в штатив при комнатной температуре. Пробирки периодически встряхивают, чтобы усилить соприкосновение раствора с кислородом воздуха. Наблюдают изменения, происходящие в пробирках. Сделайте вывод.
Опыт № 3. Реакция на сукцинатдегидрогеназу. Реактивы: 1) янтарная кислота (нейтрализованная) 2) метиленовая синь Исследуемое вещество: мышечная ткань. Ход работы: 0,3 г. хорошо измельченной мышечной ткани растирают в ступке с двенадцатикратным количеством дистиллированной воды и отфильтровывают через марлю, не отжимая. Экстракцию мышечной ткани повторяют еще раза два. После последней экстракции мышечную кашицу заливают водой и используют полученный раствор с кашицей. В две пробирки помещают по 3-4 мл р-ра мышечной кашицы. В первую пробирку прибавляют около 0,5 мл нейтрализованного раствора янтарной кислоты. Затем в обе пробирки добавляют по 1 капле метиленовой сини, встряхивают и ставят на водяную баню при 37°С. Через некоторое время наблюдают обесцвечивание раствора в одной из пробирок. В какой? Фермент сукцикатдегидрогеназа относится к анаэробным дегидрогеназам, классу оксидоредуктаз. Т.е. они участвуют в переносе водорода от окисляемого субстрата - янтарной кислоты - на какой-то промежуточный субстрат, в опыте таким промежуточным субстратом является метиленовая синь. Это фермент, коферментом которого является НАД, содержащий в качестве активного центра витамин РР. Схематично происходящие в пробирке процессы можно изобразить следующим образом: Янтарная кислота фумаровая кислота
Опыт № 4. Определение каталазы. Общие понятия. В процессе тканевого дыхания в организме образуется не только Н2О, но и Н2О2, которая является токсичным веществом и для ее устранения организм располагает ферментом, разрушающим перекись водорода на воду и кислород. Это фермент каталаза. Ее много содержится в крови, печени, молоке и в растительных продуктах. Реактивы: Н2О2 – 3% раствор Исследуемое вещество: кровь, печень, мышца и т.д.
Ход определения: В пробирку наливаем 1 мл 3% р-ра Н2О2 и добавляем немного растертой печени, мышцу или немного крови. Что наблюдаете? Сравнение реакции.
Опыт № 5. Обнаружение пероксидазы. Общие понятия. Пероксидаза, фермент, который содержится во многих растительных и животных продуктах. Содержится она в доброкачественных тузлуках. Этот фермент катализирует реакции окисления некоторых фенолов и аминов перекисью водорода или органическими перекисями.
Реактивы: 1) р-р бензидина в спирте - 1% (свежеприготовленный) Исслед. в-во: тузлук, мышца рыбы, мясо и т.д. Ход работы: Приготавливают 4 пробирки, так, как указано в таблице №4 (пр. 1,2,3,4). Таблица №4
Что наблюдаете? Дайте объяснение.
Бесцветное синее Бензидин неокрашенное соединение. При окислении он превращается в пара-дииминдихинон (п-дииминдихинон) синего цвета.
|