Количественное определение белковРазличают две группы методов: 1) Определение количества белков в растворе на основе физико-химических свойств: биуретовый метод (основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди в щелочной среде); рефрактометрический и нефелометрический методы; поглощение ультрафиолетового излучения (при 280 нм поглощают УФО остатки ароматических аминокислот, при 180-210 нм - пептидная связь и ряд конформационных факторов). 2) Количественное определение индивидуальных белков на основе их биологических свойств (радиоиммунный, иммуноферментные методы). Задача: в биологической жидкости имеется смесь белков (А+В+Х). Необходимо определить количество белка Х. Здесь общее определение количества белка не годится. Для количественного определения индивидуального белка Х в смеси белков предложен радиоиммунный метод. Рассмотрим его суть. Первый этап: приготовление реагента для определения - чистым препаратом белка Х, полученным заблаговременно, иммунизируют животное. Против этого белка в организме животного образуются антитела. Их выделяют из крови и метят 125I. Этот этап осуществляется на предприятиях, производящих наборы реагентов для радиоиммунного определения белка. Второй этап: анализируют смесь белков, добавляя к ним меченое антитело в избытке. Меченное антитело связывает из-за специфического взаимодействия только белок Х. Этот комплекс выделяют, подсчитывают радиоактивность и определяют количество метки. По количеству метки определяют количество антитела Х, т.е. искомого белка. Метод весьма чувствителен, поскольку основан на специфичности белков, т.е. специфическом комплементарном взаимодействии индивидуальных белков. В настоящее время нашел широкое распространение иммуноферментный анализ индивидуальных белков (ИФА), основанный на сродстве антитела к конкретному антигену (ELISA). ELISA включает следующие основные этапы: 1. Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, чаще используют пластиковые 96-луночные плашки. 2. К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела. 3. В лунку добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой. К этому антителу присоединен фермент, катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт (чаще, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза). Промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы конъюгата второе антитело-фермент. 4. Добавляют в лунку неокрашенный субстрат. 5. Проводят количественное (качественное) определение окрашенного продукта. Основной принцип ELISA – специфическое связывание первого антитела с мишенью (белок, клетка). Применение моноклональных антител позволило существенно повысить специфичность метода ELISA, поскольку они связываются с одним, строго определенным антигенным сайтом. Напомним, что антитела продуцируют В-клети (В-лимфоциты). Каждая клетка системы иммунитета вырабатывает одно антитело, которое распознает отдельный участок (эпитоп, антигенную детерминанту) молекулы антигена. Поскольку в молекуле антигена присутствует несколько разных эпитопов, антитела против каждого из них вырабатываются отдельными клетками системы иммунитета. Такие антитела, каждое из которых взаимодействует с данным антигеном, называют поликлональными. Они вариабельны по количеству, в связи с чем не нашли применения в методе ELISA. Известно, что В-клетки не воспроизводятся в культуре. Но после слияния с миеломными клетками удалось получить гибридомы и выделить растущие и делящиеся в культуре клоны клеток, которые продуцируют высокоспецифичные моноклональные антитела. Их и используют в методе ELISA. Если первое антитело не связывается с мишенью, то оно удаляется при первом промывании. Поскольку при этом конъюгату второе антитело-фермент не с чем связываться, он удаляется при втором промывании, и образец остается неокрашенным. Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и конъюгированный фермент катализирует образование легко регистрируемого окрашенного продукта. Моноклональные антитела широко применяются в настоящее время при определении полипептидных гормонов, маркеров опухолей, цитокинов, лекарственных препаратов, различных низкомолекулярных биорегуляторов, возбудителей инфекционных заболеваний. Для реализации методов радио- и иммуноферментного анализа требуется предварительно получить индивидуальные белки.
|
