Методика приготовления постоянных препаратов диатомовых водорослей.

Оборудование: тонкие предметные стёкла, покровные стёкла 18*18мм, фильтровальная бумага, шприц с силиконовой трубочкой, пинцет, электрическая плитка, водяная баня с держателем для пробирок, электрическая центрифуга (не менее 2000 оборотов/минуту), весы для уравновешивания пробирок, пипетка на 5 куб.см.

Реактивы: д истиллированная вода, Н₂О₂ (30 %), HCl (50 %), NH₄ (1 %), канадский бальзам.

Последовательность приготовления препарата:

ВСЕ ОПЕРАЦИИ, КРОМЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ ПРОВОДЯТСЯ ПОД ВКЛЮЧЁННОЙ ВЫТЯЖКОЙ!

Перед началом работы пронумеруйте пробирки в соответствии с номерами проб!

1. Сгустите пробы (уберите лишнюю жидкость над осадком, но не всю), очень аккуратно, чтобы не взболтать осадок!

2. Взболтайте оставшийся осадок и перелейте его в пробирки для центрифуги (в разные пробирки разные пробы). Пробирок должно быть чётное количество.

3. Попарно уравновесьте пробирки.

4. Отмойте осадок при помощи центрифуги. Для этого центрифугируйте пробирки 3 раза (2000 оборотов/мин – 15 минут, или 3000 оборотов/мин – 10 минут). Каждый раз после центрифугирования отсасывайте надосадочную жидкость при помощи шприца с насадкой из силиконовой трубки. После отсасывания жидкости осадок разводится дистиллированной водой и пробирки снова попарно уравновешивают.

5. После третьего центрифугирования слейте надосадочную жидкость и в каждую пробирку добавьте по 5мл 30 %-ной Н₂О₂ (перекись водорода). Затем поместите пробирки в водяную баню (t=80⁰С) на 2 часа. Следите за тем, чтобы вода в бане и раствор в пробирках не выкипали!

6. Отцентрифугируйте раствор один раз и слейте надосадочную жидкость.

7. К осадку добавьте по 2 капли 50 %-ной HCl в каждую пробирку. Дождитесь окончания химической реакции.

8. Отцентрифугируйте пробы 5 раз, предварительно разбавив осадок дистиллированной водой и уравновесив попарно пробирки. Не забывайте сливать надосадочную жидкость после каждого центрифугирования.

9. К полученному осадку добавьте по 2 капли 1 %-го раствора NH₄ в каждую пробирку и тщательно перемешайте.

10. Подготовленную и тщательно перемешанную смесь по 1 капле нанесите на чистое обезжиренное покровное стекло и подсушите каплю над электроплиткой до полного высыхания. Стекло над плиткой держите при помощи пинцета!

11. На предметное стекло (чистое, обезжиренное) нанесите каплю или кристалл канадского бальзама и растопите его над электроплиткой, следя за тем, чтобы бальзам не закипел.

12. Аккуратно накройте бальзам предметным стеклом так, чтобы воздух не попал под стекло.

13. Дайте бальзаму остыть.

14. Не забудьте проэтикетировать каждый препарат в соответствии с этикеткой пробы.

Методы количественного изучения собранного материала. Для подсчёта численности водорослей используют счётные камеры Нажотта, «Учинская», Горяева. Перед счётом пробу тщательно перемешивают и одну каплю вносят в камеру. Камеру закрывают покровным стеклом и после оседания водорослей проводят определение и подсчёт всех встреченных видов, кроме того, производят замеры необходимых параметров для последующего вычисления объёма клеток.

В каждой пробе необходимо определить и просчитать все виды как минимум в трёх камерах объёмом 0,9мм³ (Горяева) с последующим вычислением среднего арифметического. Каждую камеру следует просматривать при двух различных увеличениях – большом и малом – для учёта крупных и мелких форм.

Для статистической достоверности подсчёта и установления биомассы доминирующих видов необходимо, чтобы каждый из них был встречен не менее 100 раз. Пересчёт общей численности производится по формуле:

N = nv₁ / v₂w,

где N – число клеток в 1см³ воды, n – число клеток в камере объёмом 1мм³, v₁ – объём концентрата пробы, v₂ – объём камеры, w – объём профильтрованной воды; если объём профильтрованной воды и концентрата пробы постоянны (w=500см³, v₁=5см³), то формула принимает вид

N = n × 10.

Для достоверной оценки общей численности фитопланктона плотность его в пробе должна быть не менее 3 тыс.кл./мл. Степень концентрации исходной пробы необходимо устанавливать, принимая во внимание это условие.

Методы вычисления биомассы. Вычисление биомассы фитопланктона производится наиболее общепринятым в пресноводной гидробиологии методом суммирования биомасс отдельных популяций, для чего требуется установление средней массы (объёма) клеток водорослей, составляющих популяции в пробе.

Определение объёма отдельных клеток водорослей обычно осуществляется следующим образом. Каждую из встреченных особей измеряют, используя для этого окуляр-микрометр или специальную сеточку, вставленную в окуляр. Размер стороны квадрата окулярной сеточки находится сопоставлением сторон сеточки с делениями объект-микрометра, одно деление которого равно 10мкм. Форма клеток приравнивается к близкому геометрическому телу. На основании многочисленных промеров для дальнейшего вычисления биомассы, особенно доминирующих видов, получают средние значения всех необходимых параметров. Найденный для каждой клетки объём (в мкм³) умножается на её численность, и получают значение биомассы в мг/л или г/м³ с точностью до 0,01. Удельный вес водорослей условно принимается равным единице. Учитывая довольно большую вариабельность размеров клеток водорослей в зависимости от климатических зон, типов водоёмов, сезонных факторов, необходимо в каждом конкретном случае проводить замеры клеток водорослей и определять значение биомассы для исследуемого материала.