МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ 2 страница
Таблица 1
КОНЦЕНТРАЦИИ СТАНДАРТНОГО ДНК В ПРОБИРКАХ
Содержимое каждой пробирки стандартного ряда ДНК обрабатывают равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1), центрифугируют при 5000 об./мин. в течение 5 мин., собирают водный слой и осаждают двумя объемами этанола в присутствии 0,3 моль/л ацетата аммония. Пробы выдерживают 1 ч при -20 °С. Осажденные нуклеиновые кислоты собирают центрифугированием на микроцентрифуге при 13000 об./мин. в течение 6 мин. Образцы стандартного ряда с известными концентрациями клеточной ДНК денатурируют аналогично пробам полуфабрикатов исследуемых препаратов, то есть добавляют в каждую пробирку 50 мкл раствора 0,5 моль/л гидроокиси натрия и инкубируют 20 мин. при температуре 18 - 25 °С. Далее нейтрализуют равным объемом нейтрализующего раствора и помещают на ледяную баню, затем наносят на мембрану через лунки. Аппарат для дот-гибридизации подключают к водоструйному насосу, чтобы растворы образцов полностью просочились через мембрану. Лунки промывают 200 мкл раствора 5х раствора SSC. Далее мембрану вынимают из аппарата, высушивают на фильтровальной бумаге при температуре 18 - 25 °С. Для иммобилизации ДНК на мембране мембрану облучают ультрафиолетовым светом в течение 2-х мин. или выдерживают 2 ч при 80 °С. Проведение реакции гибридизации Мембрану с образцами ДНК помещают в полиэтиленовый пакет, запечатывают при помощи аппарата "Молния", оставляя небольшое отверстие для внесения в пакет растворов. Раствор для предгибридизации, подогретый до 42 °С, вносят автоматической пипеткой в пакет из расчета 0,20 мл на 1 см мембраны. Выдавливают как можно больше воздуха из мембраны, запечатывают отверстие нагреванием, помещают пакет между двумя стеклами и помещают в водяную баню при 42 °С на 2 - 3 часа. По истечении времени предгибридизации пакет вскрывают, отрезав один угол ножницами. Сливают раствор для предгибридизации как можно полнее и в пакет вносят раствор для гибридизации из расчета 0,10 мл на 1 см мембраны. Раствор для гибридизации - это тот же раствор для -32 предгибридизации, но содержащий меченую (альфа Р) ДНК. Меченую радиоактивным фосфором и очищенную ДНК (2,0 x 10 имп./мл раствора предгибридизации) перед добавлением в раствор для гибридизации прогревают при температуре 100 °С 5 мин., с последующим быстрым охлаждением на ледяной бане. Из пакета удаляют воздух, запаивают отрезанный угол и инкубируют пакет с мембраной между стеклами в водяной бане при температуре 42 °С в течение 24-х ч. Отмывка мембраны После окончания инкубации вынимают пакет из водяной бани, разрезают его вдоль 3-х сторон, вынимают мембрану и немедленно погружают в сосуд с раствором А при температуре 18 - 25 °С. Через 5 мин. переносят мембрану в другой сосуд, содержащий раствор Б, и инкубируют в течение 15 мин. при температуре 18 - 25 °С, периодически помешивая. Затем переносят мембрану в сосуд с тем же раствором и инкубируют 2 часа при температуре 65 °С, слегка покачивая. Меняют буфер на свежий и еще раз инкубируют 30 мин. при температуре 18 - 25 °С, периодически помешивая. Нельзя допускать высыхания мембраны ни на одном этапе промывания. После промывки мембрану высушивают на воздухе при температуре 18 - 25 °С. Радиоавтография Сухую мембрану заворачивают в пленку типа "Saran wrap" ("Амершам", США) и помещают в кассету для рентгеновской пленки с усиливающим экраном Э4-В3А. Туда же помещают рентгеновскую пленку (ТУ 6-17-1245-83) типа РМ-В, кассету закрывают и экспонируют при температуре -70 °С в течение 1 - 3 суток. Далее пленку проявляют погружением в раствор проявителя на 5 - 6 мин. (в темноте). Затем пленку промывают холодной водопроводной водой и погружают в раствор фиксатора на 10 мин., после чего промывают холодной водой и высушивают. Оценка результатов На местах нанесения ряда известных разведений очищенных клеточных ДНК и на местах нанесения ДНК из образцов исследуемых препаратов (если она в них присутствует) на рентгеновской пленке появляются темные пятна. Количество примеси ДНК в образцах препаратов определяют визуально или при помощи денситометра путем сравнения интенсивности потемнения пятен в месте нанесения исследуемых проб с калибровочным рядом известных количеств клеточных ДНК. В соответствии с требованиями ВОЗ и национальными руководящими документами количество примесей клеточных ДНК в биотехнологических препаратах должно быть менее 100 пкг на дозу. Для препаратов, предназначенных для многократного введения людям, содержание примеси клеточных ДНК должно быть менее 10 пкг на дозу. Примечания. I. Приготовление растворов 1. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 8,0. 121,1 г трис(гидроксиметил)аминометана помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 700,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения. Доводят pH до 8,0 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят объем до 1000 мл деионизованной водой и фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4 - 6 °С. 2. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 7,2. 121,1 г трис(гидроксиметил)аминометана помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 700,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят pH до 7,2 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой и фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4 - 6 °С. 3. Раствор динатриевой соли ЭДТА (трилон-Б) концентрации 0,5 моль/л, pH 8,0. 18,6 г ЭДТА динатриевой соли помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды, добавляют 45%-ный раствор гидроокиси натрия до полного растворения. Доводят pH до 8,0 45%-ным раствором гидроокиси натрия (NaOH). Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой, фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4 - 6 °С. 4. Буферный раствор ТЕ. 1,0 мл раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 8,0, вносят в градуированный химический стакан, прибавляют 0,2 мл буферного раствора трилона-Б концентрации 0,5 моль/л, pH 8,0, и доводят деионизованной водой до 100,0 мл. Раствор хранят в течение месяца при 4 - 6 °С. 5. 10%-ный раствор SDS. 50,0 г додецилсульфата натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 300,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 500,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 18 - 25 °С. 6. Раствор ацетата аммония концентрации 5 моль/л. 38,5 г ацетата аммония помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой и фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят при 4 - 6 °С. 7. Раствор водонасыщенного фенола. 100,0 мл расплавленного фенола наливают в емкость и прибавляют 100,0 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 8,0. Содержимое емкости перемешивают стеклянной палочкой. Раствор хранят при 4 - 6 °С в течение 1 - 2-х мес. 8. Раствор РНК-азы 1. 0,01 г РНК-азы 1 помещают в пробирку для микропроб и растворяют в 1,0 мл деионизованной воды. Раствор хранят при -20 °С. 9. Раствор NaOH концентрации 5 моль/л. 20,0 г гидроокиси натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 18 - 25 °С. 10. Раствор MgCl2 концентрации 1 моль/л. 20,0 г магния хлористого шестиводного помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Плотность раствора ро = 1,075. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят при 4 - 6 °С в течение 1 - 2-х мес. 11. Раствор ДНК-азы 1. 0,001 г ДНК-азы 1 помещают в пробирку для микропроб и растворяют в 0,1 мл 10%-ного раствора SDS, прибавляют 0,4 мл деионизованной воды и 0,5 мл глицерина. Содержимое пробирки перемешивают и хранят при -20 °С. 12. Раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов концентрации 0,001 моль/л. 2,9 мг дезоксиаденозинтрифосфата, 3,1 тимидинтрифосфата и 3,0 мг дезоксигуанидинтрифосфата помещают в пробирку и растворяют в 5,0 мл деионизованной воды. Раствор разливают по 0,5 мл в пробирки для микропроб и хранят при -20 °С в течение шести месяцев. 13. Буферный раствор для ник-трансляции. 1,5 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) помещают в пробирку, прибавляют 5,0 мл раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 7,2, 1,0 мл раствора MgCl2 концентрации 1 моль/л и доводят раствор до 10 мл деионизованной водой. Раствор хранят в течение 6-ти месяцев при -20 °С. 14. Приготовление сефадекса G-25. В химический стакан наливают 80,0 мл раствора ТЕ и медленно прибавляют 5,0 г сефадекса G-25. Оставляют на ночь при 18 - 25 °С. Хранят суспензию при 4°С. 15. 20х раствор SSC (лимоннокислый натрий с натрием хлористым) концентрации 3 моль/л. 173,0 г натрия хлористого и 88,2 г лимоннокислого натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 700,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Хранят раствор при 18 - 25 °С в течение 2-х месяцев. 16. 5х раствор SSC (лимоннокислый натрий с натрием хлористым) концентрации 0,6 моль/л. 5,0 мл 20х раствора SSC вносят в градуированный химический стакан и доводят объем до 20,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 18 - 25 °С в течение недели. 17. Нейтрализующий раствор. 0,87 г хлорида натрия помещают в градуированную мерную пробирку, прибавляют 5,0 мл раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л, pH 8,0, и прибавляют 0,42 мл концентрированной НСl. Доводят объем до 10 мл деионизованной водой, фильтруют через стеклянный фильтр GF/B и хранят при 18 - 25 °С в течение месяца. 18. Очистка формамида. 5,0 г смешанной катионанионионообменной смолы помещают в градуированный химический стакан и заливают 50,0 мл формамида, перемешивают магнитной мешалкой 30 - 40 мин. при 18 - 25 °С. Чистый формамид отделяют от смолы через стекловолокнистый фильтр GF/B. Хранят раствор при -20 °С. 19. Раствор денатурированной спермы лосося. 400,0 мг ДНК спермы лосося помещают в емкость, прибавляют 20,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Затем кипятят раствор ДНК в течение 10 мин. на водяной бане, разливают по 1,0 мл в пробирки для микропроб и хранят при -20 °С в течение 2-х месяцев. 20. Раствор Денхарда 100х. 1,0 г фикола, 1,0 г поливинилпиролидона, 1,0 г БСА помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 30,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 50,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр GF/B и хранят при -20 °С в течение 2-х месяцев. 21. Раствор для предгибридизации. В градуированный химический стакан вносят 25,0 мл раствора формамида, 0,75 мл раствора денатурированной ДНК спермы лосося, 2,5 мл 10%-ного раствора SDS, 12,5 мл 20х раствора SSC, 2,5 мл 100х раствора Денхарда и доводят объем до 50,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят при -20 °С в течение месяца. 22. Раствор для гибридизации. Это тот же раствор для предгибридизации, но содержащий меченую -32 альфа Р ДНК. Меченную радиоактивным фосфором и очищенную ДНК (2,0 x 10 имп./мл) перед добавлением в раствор для гибридизации прогревают при 100 °С 5 мин. и быстро охлаждают на ледяной бане. Раствор готовят перед использованием. 23. Раствор для отмывки мембраны. Раствор А (2х раствор SSC с 0,5%-ным раствором SDS). В градуированный химический стакан помещают 50,0 мл 20х раствора SSC, 25,0 мл 10%-ного раствора SDS и доводят объем до 500,0 мл деионизованной водой. Раствор готовят перед использованием. Раствор Б (0,2х раствор SSC с 0,1%-ным раствором SDS). В градуированный химический стакан помещают 5,0 мл 20х раствора SSC, 10,0 мл 10%-ного раствора SDS и доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой. Раствор готовят перед использованием. 24. Раствор проявителя. К 700,0 мл деионизованной воды (температура воды 60 °С), 2,2 г метола, 8,8 г гидрохинона, 72,0 г безводного сульфита натрия, 48,0 г карбоната натрия и 4,0 г бромистого калия по очереди помещают в градуированный химический стакан и по очереди растворяют. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой. Хранят раствор при 18 - 25 °С в темной посуде. 25. Раствор фиксатора. 160,0 г тиосульфата натрия, 40,0 г хлористого аммония помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 730,0 мл деионизованной воды (температура воды 60 °С) и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой и хранят при 18 - 25 °С в темной посуде. 26. 10%-ный раствор ТХУ. 10,0 г трихлоруксусной кислоты помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 4 - 6 °С. 27. Сцинтилляционный раствор. 4,0 г РРО (2,5-дифенилоксазола), 0,2 г РОРОР (1,4-ди(2-(5-фенилоксазолил)бензина)) помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 730,0 мл толуола, перемешивают до полного растворения стеклянной палочкой. Доводят объем до 1000,0 мл толуолом. Хранят раствор при 18 - 25 °С в темной посуде. При отборе проб используют автоматические пипетки с соответствующими диапазонами объемов: от 1 мкл до 10 мкл; от 5 мкл до 40 мкл; от 40 мкл до 200 мкл; от 200 мкл до 1000 мкл; от 1 мл до 5 мл.
7. Испытание на стерильность
Испытание на стерильность проводят с применением "Сухой питательной среды для контроля стерильности (тиогликолевой)" отечественного производства. Возможен выпуск варианта среды без тиогликолята натрия в составе сухого вещества. В этом случае тиогликолят натрия или тиогликолевую кислоту добавляют ex tempore. Вместо коммерческой тиогликолевой среды может быть использована тиогликолевая среда индивидуального приготовления. Контроль стерильности МИБП проводят путем поэтапного исследования образцов готового препарата в полуфабрикате и готовой серии препарата. Готовым препаратом в полуфабрикате считают препарат, находящийся в одной производственной емкости (или разлитый в бутылки из этой емкости), из которой производят розлив в ампулы или флаконы. Примечание. Контроль полуфабриката на более ранних стадиях должен осуществляться в соответствии с технологическими регламентами.
7.1. Правила отбора образцов препарата для испытания на стерильность Образец для контроля - это количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду по представленной ниже схеме (не менее 2 мл). В том случае, если емкости (ампулы или флаконы) содержат меньший объем препарата, то образец составляют из смеси содержимого нескольких емкостей. 7.1.1. Отбор образцов готового препарата в полуфабрикате Объем выемки готового препарата в полуфабрикате для испытания на стерильность должен быть достаточным, чтобы обеспечить достоверность результатов контроля, но не менее 10 мл. Перед отбором выемки содержимое производственной емкости, в которой находится полуфабрикат, тщательно перемешивают. Взятая проба должна быть посеяна в виде 5-ти или более образцов по схеме 7.4 и с учетом антимикробного действия п. 7.2. 7.1.2. Отбор образцов препарата в процессе розлива В процессе розлива препарата для испытания на стерильность берут не менее чем по одному образцу в начале, середине и в конце розлива. Для контроля могут быть взяты пробы, отобранные в процессе розлива в отдельные лабораторные емкости (пробирки, флаконы) или герметизированные емкости, в которые осуществляется розлив препарата. Примечание. При розливе препаратов, которые в дальнейшем подвергаются лиофильному высушиванию, необходимо оставлять до окончания контроля стерильности высушенной продукции утроенное количество образцов (не менее 9-ти) разлитого жидкого препарата в герметизированном виде. Эти образцы могут быть исследованы в случае пророста образцов высушенного препарата для выяснения причин контаминации.
7.1.3. Отбор образцов готового препарата При контроле стерильности готового (разлитого, высушенного) препарата количество контролируемых емкостей (ампул или флаконов) определяется с учетом общего количества емкостей в серии. Для определения минимального числа емкостей, необходимого для контроля стерильности, следует произвести расчет по формуле:
__ n = 0,4 \/N,
где: n - необходимое для контроля число емкостей, не менее 10-ти и не более 40; N - число емкостей в серии. Принимая во внимание, что за образец для контроля принято количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду (не менее 2 мл), число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов может не совпадать. В случаях, когда объем препарата в каждой емкости равен или превышает 2 мл, число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов будет одинаковым или количество образцов будет превышать число емкостей, взятых для испытания. При меньшем объеме розлива (менее 2 мл в емкости) число засеваемых образцов будет меньше, чем число контролируемых емкостей, за счет объединения нескольких емкостей в один образец. Для удобства расчетов предлагаются таблицы 1 и 2, позволяющие определить число емкостей и образцов, необходимое для испытания на стерильность с учетом объема серии и количества препарата в каждой емкости.
Таблица 2
КОЛИЧЕСТВО ИСПЫТУЕМОГО ПРЕПАРАТА, НЕОБХОДИМОЕ ДЛЯ ПОСЕВА, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОБЪЕМА СОДЕРЖИМОГО ЕМКОСТЕЙ, СОСТАВЛЯЮЩИХ СЕРИЮ
┌────────────┬────────────────────────────┬──────────────────────┐ │Объем содер-│Минимальный объем препарата,│ Минимальный объем │ │жимого одной│ взятый для посева из │ тиогликолевой среды │ │емкости (мл)│ каждой емкости (мл) │для каждой температуры│ ├────────────┼────────────────────────────┼──────────────────────┤ │Менее 2 │Весь объем, объединения │В 10 раз больше объема│ │ │емкости до 2 │препарата, взятого для│ │2 - 24 │2 │посева из каждой │ │25 - 100 │6 │емкости │ │более 100 │10 │ │ └────────────┴────────────────────────────┴──────────────────────┘
Примечания. 1. Число емкостей, необходимое для контроля стерильности на предприятии, представляет собой суммарное число емкостей, контролируемых на разных этапах, - не менее n/2 в производственном отделении и не менее n/2 в ОБК. 2. Если серия включает в себя менее 500 емкостей, количество контролируемых емкостей должно быть не менее 10-ти. 3. При необходимости, с учетом особенностей технологического изготовления отдельных видов препаратов и особенностей фасовки, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные требования в отношении необходимого количества контролируемых емкостей, обеспечивающие надежность контроля стерильности препарата. 4. При отбраковке разлитого препарата из-за несоответствия физических свойств требованиям НТД (помутнение, появление хлопьев) отбракованные ампулы или флаконы должны быть переданы в ОБК для выяснения характера помутнений и, при необходимости, проведения контроля стерильности.
Количество емкостей, отправленное в ГИСК им. Л.А. Тарасевича, должно соответствовать общему количеству, контролируемому в производственном отделе и в ОБК, с учетом величины серии и объема препарата, разлитого в ампулы или флаконы. 7.2. Определение антимикробного действия МИБП Во избежание неправильной оценки испытания на стерильность необходимо определить для каждого наименования МИБП (в том числе и для их полуфабрикатов), обладает ли он антимикробным действием. Для этого в каждые две пробирки с 20 мл тиогликолевой среды вносят по 1,0 мл исследуемого препарата и добавляют по 0,1 мл микробной взвеси соответствующего тест-штамма в разведении 1000 клеток/мл. Содержимое пробирок осторожно перемешивают до равномерного распределения препарата в питательной среде. Посевы со штаммами для определения антимикробного действия инкубируют при температуре от 30 до 35 °С в течение 48 часов, а для определения антигрибкового действия от 20 до 25 °С в течение 72-х часов. В контрольные образцы вместо исследуемого препарата вносят аналогичное количество физиологического раствора и соответствующие тест-штаммы. Для проверки антимикробного действия МИБП используют тест-микроорганизмы: Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р; Bacillus subtilis. АТСС 6633; Escherichia coli АТСС 25922, а для противогрибкового действия - Candida albicans АТСС 885-653. При отсутствии антимикробного действия МИБП в опытных и контрольных пробирках должен наблюдаться рост перечисленных тест-микроорганизмов в указанные сроки. При наличии антимикробного действия возможно торможение роста одного или нескольких тест-штаммов, при сохранении их роста в контрольных образцах. При выявлении антимикробного действия препарат разводят, изменяя соотношение объемов посевного материала и питательной среды. Первоначально увеличивают объем питательной среды до 250 мл. Если при этом сохраняется антимикробное действие МИБП, уменьшают объем посевного материала до 0,5 мл в каждой из 2-х пробирок (флаконов). Экспериментально установленное соотношение объемов питательной среды и посевного материала, обеспечивающее нейтрализацию антимикробного действия препарата, должно соблюдаться при испытании его на стерильность методом прямого посева. В случае неэффективности разведения МИБП используют метод мембранной фильтрации. 7.3. Техника проведения контроля стерильности Перед внесением в бокс ампулы (флаконы) с препаратами должны быть проверены на герметичность путем тщательного просмотра, а препараты, высушенные под вакуумом, должны быть проверены на вакуум. После этого ампулы (флаконы) обрабатывают методом погружения в 3%-ный раствор перекиси водорода не менее чем на 2 мин. Лица, проводящие контроль стерильности, непосредственно перед работой в боксе тщательно моют руки с мылом при помощи щетки. В предбокснике обувь меняют на специальную боксовую, надевают стерильный халат, колпак или косынку и 4-слойную марлевую повязку (маску), которая должна закрывать нос и рот. При работе в боксе движения, разговоры, перемещения должны быть максимально ограничены. В начале и в конце посева образцов каждой серии проводится обработка рук 70° спиртом, а поверхности рабочего стола 96° спиртом с последующим прожиганием (при посеве, насчитывающем более 30 емкостей одной серии, подобная обработка проводится также и в середине посева этой серии). Перед вскрытием ампул или флаконов оттянутый конец ампулы или горлышко флакона смачивают 96° спиртом и обжигают в пламени горелки. Исследуемый препарат набирают стерильной пипеткой при помощи ножной или ручной груши, предварительно автоклавированной. Перед забором препарата пустая пипетка проводится через пламя горелки, но не прокаливается. Посев каждого образца препарата производят отдельной стерильной пипеткой на внутреннюю стенку пробирки у раздела сред (необходимо избегать вдувания воздуха в питательную среду). Использованные пипетки, ампулы и флаконы от препаратов помещают в 3%-ный раствор перекиси водорода и оставляют на 24 часа, после чего производится их дальнейшая обработка. Примечания. 1. Запрещается прокаливать ампулы и пастеровские пипетки в пламени горелки. 2. Запрещается производить посев пипеткой без груши (ртом).
Перед посевом жидких препаратов содержимое ампул или флаконов необходимо встряхивать (т.к. микробы-контаминанты могут осесть на дно). Образцы сухих препаратов предварительно растворяют тиогликолевой средой или стерильным растворителем (изотонический раствор хлорида натрия, дистиллированная вода и т.п.) в объеме, предусмотренном технической документацией, и после растворения засевают на питательную среду. Стерильность используемого растворителя проверяют путем его посева (по 1 мл) на 2 пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Пробирки выдерживают при температуре 30 - 35 °С и 20 - 22 °С соответственно 14 сут. одновременно с опытными пробирками. Посев растворителя для контроля стерильности производят до начала работы и после ее окончания. Если при посеве сухих препаратов используют несколько флаконов растворителя, стерильность каждого должна быть проверена аналогичным способом. Примечание. Растворение препаратов тиогликолевой средой не используют для метода мембранной фильтрации.
7.4. Схема контроля стерильности 7.4.1. Метод прямого посева Контролируемый на стерильность образец засевают пипеткой по 1 мл на две пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды, одну из которых инкубируют при температуре от 30 до 35 °С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую - при температуре от 20 до 25 °С для выявления грибов и бактерий с оптимумом роста в данном температурном режиме. Продолжительность инкубации посевов составляет не менее 14 сут. В течение всего срока проводится их периодический просмотр. Для препаратов, вызывающих помутнение питательной среды (препараты, содержащие сорбенты, микробную массу, мозговую ткань и т.п.), посев производят по указанной выше схеме, но на 5 - 7 сутки из каждой пробирки производят пересев приблизительно по 0,5 мл на две пробирки, содержащие по 10,0 мл тиогликолевой среды. Все пробирки выдерживают после пересева при соответствующих температурах до окончания инкубации (14 сут.) со дня первичного посева. Примечание. При необходимости, с учетом особенностей технологии изготовления отдельных видов препаратов, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные экспериментально обоснованные требования в отношении срока и режима инкубации.
7.4.2. Метод мембранной фильтрации При определении стерильности МИБП, обладающих выраженным антимикробным действием, и МИБП, разлитых в емкости более 100 мл, используют метод мембранной фильтрации. Аппаратура В работе используют любую, подходящую для этих целей фильтрационную систему, состоящую из закрытого резервуара и приемника, между которыми помещают закрепленную надлежащим образом мембрану, а также насоса, обеспечивающего фильтрацию жидкости. Фильтрационные системы делятся на два типа: в одних мембрану после завершения процедуры фильтрации асептически извлекают, делят пополам и погружают в две емкости со 100 мл тиогликолевой среды для последующей инкубации при температурах от 30 до 35 °С и от 20 до 25 °С (тип I); в других - мембраны закреплены в двух резервуарах, куда после фильтрации помещают по 100 мл тиогликолевой среды, для последующей инкубации в этих же емкостях при соответствующих температурах (тип II). Установки второго типа могут быть многоразового использования (их стерилизуют в собранном виде, вместе с мембраной, насыщенным паром при избыточном давлении (0,11 +/- 0,02) МПа/(1,1 +/- 0,2) кгс/кв. см и температуре (121 +/- 1) °С в течение 18 - 20 мин.) или одноразовые стерильные системы (например, стеритесты фирмы Millipore для Steritest Compact System). Используют мембраны с размером пор 0,47 мкм, диаметром 47 мм, скорость прохождения потока 55 - 75 мл/мин. при давлении 93,3 кПа (70 см рт. ст.).
|
