Эндонуклеазы рестрикции типа II

В системах рестрикции-модификации II-го типа нуклеазная и метилтрансферазная активности в большинстве случаев обеспечиваются независимыми белками. Рестрицирующие ферменты, входящие в системы этого типа, включают 11 подгрупп, которые отличаются, в основном, по структуре участка узнавания для фермента, а также по расположению позиции расщепления обеих нитей ДНК относительно узнаваемого сайта. Эндонуклеазы II-го типа разрезают ДНК в строго определенных позициях внутри или около сайта узнавания, в результате концы ДНК в месте разрыва имеют 3’-гидроксильные и 5’-фосфатные группы, способные к восстановлению фосфодиэфирных связей, т.е. к восстановлению полинуклеотидной цепочки в обеих нитях ДНК. Ввиду данных особенностей, эндонуклеазы этого типа особенно широко используются в генетической инженерии для получения рекомбинантных ДНК.

Для функционирования ферментов типа II не требуется АТФ или другие источники энергии. В системах рестрикции-модификации из разных источников активные нуклеазы могут существовать в виде мономера, гомодимера или гомотетрамера.

Большинство рестрицирующих эндонуклеаз класса II узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому эти ферменты делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие эндонуклеазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Например, в ДНК бактериофага Т7, состоящей из 40000 пар оснований, отсутствует последовательность, представляющая собой гексануклеотид GAATTC, который узнает фермент EcoRI (из Escherichia coli). Например, к мелкощепящим относятся эндонуклеазы HpaII (из Haemophilus parainfluenzae) и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - EcoRI и HindIII (из Haemophilus influenzae). Если предположить, что участки узнавания эндонуклеаз рестрикции распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований.

Последовательности нуклеотидов двуцепочечной ДНК, узнаваемые эндонуклеазами рестрикции II типа (сайты рестрикции) часто представляют собой палиндромы. Точки узнавания рестриктазами симметричны относительно поворота на 180^оС, то есть последовательность нуклеотидов слева направо в одной нити ДНК такая же, как справа налево в другой (рис. 2).Палиндромные участки узнавания и разрезания могут быть представлены также пятью парами, где средний нуклеотид может быть любым из четырех нуклеотидов (HinfI),

 

Рис. 2. Примеры палиндромных участков узнавания ДНК для эндонуклеаз рестрикции.

 

Расщепление происходит в фиксированном положении внутри сайта рестрикции или непосредственно вблизи него. При этом различные фрагменты вызывают образование как липких, так и тупых концов на фрагментах ДНК.

Эндонуклеазы рестрикции могут узнавать непалиндромные участки и разрезать ДНК на некотором расстоянии от них. В таких случаях образуются одноцепочечные выступащие концы длиной в один нуклеотид

• MboII 5’– GGTGANNNNNNNN↓–

• CCACTNNNNNNN↑ - 5’

 

Полностью метилированный сайт не подвержен ни рестрикции, ни модификации. Полуметилированный сайт не узнается ферментом рестрикции, но может быть превращен с помощью метилтрансферазы в полностью метилированный. У бактерий метилирование, как правило, связано с сохранением имеющегося состояния модификации. Репликация полностью метилированной ДНК ведет к образованию полуметилированной ДНК. Вероятно, узнавание полуметилированных сайтов представляет собой обычный этап функционирования метилтрансферазы in vivo. Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат либо для рестрикции, либо для модификации in vitro. В клетке немодифицированная ДНК с большей вероятностью будет рестрицирована. Реакция разрезания осуществляется в две ступени. Сначала происходит гидролиз одной цепи ДНК, а затем – другой.

Среди пятисот рестрицирующих ферментов, выделенных из различных микроорганизмов, встречаются такие, которые узнают на ДНК одни и те же последовательности. Такие пары или группы называют изошизомерами. Первый выделенный фермент для узнавания и специфического разрезания заданной последовательности, называют прототипом, а все остальные подобные рестриктазы называют изошизомерами. Различают истинную изошизомерию: SphI (CGTAC↓G) и BbuI (CGTAC↓G), когда ферменты узнают и гидролизуют одну и ту же последовательность нуклеотидов ДНК в одних и тех же точках, и ложную,: XmaI (C↓CCGGG) и SmaI (CCC↓GGG), когда ферменты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят разрывы в разных точках в пределах того же сайта. Совсем недавно предложено такие ферменты, как XmaIи SmaI, называть гетерошизомерами. Рестриктазы, разпознающие совершенно разные последовательности, но образующие одинаковые концы, называют изокаудомерами: MboI (↓ GATC) и BamHI (G↓ GATC C).