Тема. Тонкослойная хроматография

Тонкослойная хроматография (ТСХ) – распространенный метод хроматографического анализа небольших количеств веществ самой разнообразной природы. К достоинствам метода следует отнести простоту, наглядность и быстроту.

В ТСХ разделение компонентов осуществляется в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Пластины для ТСХ можно изготавливать самостоятельно, либо использовать пластины заводского изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по типу сорбента и размерам его зерен, так и по материалу подложки (стекло, алюминиевая фольга или полимерная пленка). Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др. вещества, которые способны удерживать зерна сорбента на подложке. Слой сорбента должен быть равномерным по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

В основе разделения веществ методом ТСХ лежит различие в степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе (сорбенте). Адсорбция компонентов осуществляется за счет «Ван-дер-ваальсовых» сил (физическая сорбция) или химического взаимодействия адсорбента и адсорбата (хемосорбция, ионный обмен). Разделение веществ в ТСХ может осуществляться и по распределительному механизму, когда подвижная и неподвижная фазы – несмешивающиеся друг с другом жидкости. Различие в коэффициентах распределения компонентов между фазами приводит к разделению веществ.

Одним из основных показателей в ТСХ является величина Rf. Этот параметр связан с временем удерживания и зависит как от свойств разделяемых веществ, состава подвижной фазы и сорбента, так и от условий хроматографирования. Значения Rf определяют как отношение расстояния, пройденного центром зоны вещества, к расстоянию от линии старта до фронта растворителя.

Если пятно имеет круглую форму и небольшой размер, то величина Rf - рассчитывается до второго знака после запятой. Если же полученное пятно размыто и имеет неправильную форму, то Rf такого пятна вычисляют с точностью до первого знака после запятой.

Наиболее распространенным сорбентом является силикагель – гидратированная кремневая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия с последующей сушкой полученного золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (обычно 5–20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров выступают ОН–группы. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Оксид алюминия является слабоосновным сорбентом и используется в основном для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на основе оксида алюминия является обязательная активация поверхности перед использованием в сушильном шкафу при температуре 100–150°С и низкая по сравнению с силикагелем, адсорбционная емкость слоя.

Кизельгур - сорбент, полученный из природных минералов: диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем.

Целлюлоза – тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром 50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом.

В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента пользуют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или активные сульфогруппы, участвующие в ионном обмене. Тонкослойная хроматография на такого типа пластинках проводится с подвижными фазами, содержащими сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений.

Вышеперечисленные сорбенты являются наиболее распространенными, но помимо них существует множество веществ, используемых как сорбенты. К ним относятся тальк, сульфат кальция, крахмал и ид. В то же время даже указанные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств (пропитка сорбентов реактивами, например нитратом серебра). Именно такое разнообразие возможных фаз при минимальных затратах позволяет использовать ТСХ для огромного числа веществ.

В качестве подвижной фазы используют либо чистые растворители (этилацетат, бензол и т. п.), либо их смеси. Подбор подвижной фазы проводится последующим правилам.

1. Разделяемые компоненты должны иметь сравнительно небольшую растворимость в подвижной фазе (если растворимость вещества высокая, то они будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости – оставаться на старте). В распределительной хроматографии растворимость

веществ должна быть выше в подвижной фазе, чем в неподвижной.

2. Состав подвижной фазы должен быть постоянным и легко воспроизводимым.

3. Подвижная фаза не должна вызывать химические изменения разделяемых компонентов.

4. В выбранной подвижной фазе анализируемые вещества должны иметь различные значения Rf и распределяться по всей длине хроматограммы. Значение Rf должно быть в пределах 0,05–0,85.

5. При выборе подвижной фазы необходимо учитывать природу разделяемых веществ. Так, при хроматографировании веществ, имеющих основные свойства, подвижная фаза не должна обладать кислотными свойствами, и наоборот.

По направлению движения растворителя различают восходящую, нисходящую, двумерную и радиальную ТСХ.

Метод восходящей тонкослойной хроматографии наиболее распространен и основан на том, что фронт растворителя поднимается по пластине под действием капиллярных сил. Для этого метода используется наиболее простое оборудование, так как в качестве хроматографической камеры можно использовать любую емкость с плоским дном и плотно закрывающейся крышкой, в которую свободно помещается хроматографическая пластинка. Метод восходящей ТСХ имеет ряд своих недостатков. Так, поднятие фронта растворителя по пластинке происходит неравномерно: в нижней части скорость движения растворителя самая высокая, а по мере поднятия фронта уменьшается. Связано это с тем, что в верхней части камеры насыщенность парами растворителя меньше, поэтому растворитель с хроматографической пластинки испаряется интенсивнее, следовательно, уменьшается его концентрация, и скорость движения замедляется. Для устранения этого недостатка по стенкам хроматографической камеры прикрепляют полоски фильтровальной бумаги, по которым поднимающаяся подвижная фаза насыщает парами камеру по всему объему.

Техника нанесения исследуемых растворов. Нанесение исследуемого вещества – простая операция, но вместе с тем, она сильно влияет на результаты хроматографирования. В ТСХ принято использовать концентрации растворов ~ 1%, хотя чувствительность метода позволяет определять вещества с гораздо меньшими концентрациями. Если в исследуемой смеси неизвестна общая концентрация компонентов, то сначала необходимо определить какое количество исследуемого раствора достаточно для получения качественных хроматограмм. Для этого на пластину наносят несколько пятен анализируемой смеси, равные по размеру, но различающиеся по количеству вещества (например, 1, 2, 5 мкл). После храмотографирования изучают форму и размеры разделенных пятен. При правильно подобранной концентрации форма пятен разделенных компонентов такая же, как и форма пятна, нанесенного на линию старта. Если пятна разделенных компонентов имеют размеры гораздо большие, чем пятно на старте, то нанесенное количество вещества слишком велико. Появление «хвостов», неправильная форма разделенных пятен говорит о чрезмерном количестве нанесенного на пластину вещества, но может быть и следствием неудачного выбора подвижной фазы. Подбором количества нанесенного вещества системы растворителей можно добиться полного разделения на одной пластинке до десяти компонентов. Анализируемые вещества с помощью капилляров наносят на «линию старта», которая располагается на расстоянии 1–2 см от нижнего края пластины. Это связано с тем, чтобы при опускании пластины в систему не происходило растворение в ней образцов, а все нанесенное вещество подверглось хроматографированию. Размер наносимого пятна не должен превышать 1–2 мм, расстояние между наносимыми пятнами должно быть 0,5–1 см. Нанесение на пластины исследуемых веществ не должно сопровождаться разрушением сорбента (что довольно сильно влияет на качество разделения), поэтому капля должна наноситься касанием, а не надавливанием капилляра о слой сорбента. Следует отметить, что на размер образующегося пятна влияет не только количество нанесенного раствора, но и полярность растворителя и его температура кипения. После нанесения исследуемых веществ на пластинку, необходимо добиться полного удаления растворителя, так как даже его не большое содержание в исследуемом веществе может повлиять на разделение. Удаление растворителей обычно проводят естественной сушкой пластин в течение 5–10 мин.

После разделения исследуемых веществ пластины сушат. Если подвижная фаза имеет в своем составе только низкокипящие компоненты, то достаточно естественной сушки пластины в течение 3–5 мин. Если же в состав системы входят высококипящие жидкости (спирты, вода, органические кислоты и т. п.), то пластины следует сушить на воздухе не менее 10 мин или помещать в сушильный шкаф.

Высушенная пластина является первичной хроматограммой исследуемых веществ.

Идентификация разделенных веществ. Для идентификации разделенных веществ в ТСХ используются следующие методы: пластинку рассматривают в видимом (если вещества окрашены) или в ультрафиолетовом свете (если вещества бесцветны). Если качество хроматограмм хорошее (отсутствие «хвостов» разделяемых веществ, хорошее разделение зон, их правильная форма), то определяют значения Rf пятен. Величины Rf в сочетании с окраской и формой пятен используются для идентификации компонентов.

Необходимо помнить, что значения Rf являются качественной характеристикой компонентов для строго определенных условий хроматографирования. Поэтому при проведении исследований веществ с предполагаемым составом применяют метод хроматографирования со свидетелем - известным веществом.

Для определения местоположения компонентов и идентификации конкретных соединений в ТСХ используется также проявление хроматограмм (обработка серной кислотой, парами иода и т. п.).

Достоинство ТСХ состоит и в том, что после хроматографирования каждое разделенное вещество можно в дальнейшем исследовать другими методами. Для этого необходимо снять соответствующий компоненту слой сорбента, элюировать из него вещество и исследовать его с помощью ИК- и УФ-спектроскопии, ЯМР и т. д. Метод ТСХ можно использовать и как препаративный, т.е. для наработки небольшого количества вещества, в том числе и для свидетеля.