НСТ-тест

 

Для оценки уровня активности МФ используется полярографический метод (потребление кислорода), НСТ-тест (восстановление нитросинего тетразолия), йодирование (переход радиоактивного меченого йода в кислотонерастворимый осадок), окисление глюкозы (образование молекул 14СО₂ при окислении глюкозы-1-14С). Данные тесты основаны на том, что активация МФ сопровождается кислородзависимым метаболическим “взрывом”. Классическим из данных методов стал НСТ-тест. Дело в том, что активированные фагоциты способны поглощать нитросиний тетразолий (НСТ) и восстанавливать его в формазан. НСТ-тест позволяет дифференцировать активированные и интактные фагоциты, но его нельзя считать количественным, так как визуальная оценка результатов субъективна.

Проведение теста НСТ во многих случаях помогает оценить бактерицидные кислородзависимые системы нейтрофильных гранулоцитов. Этот тест ставился в двух вариантах – спонтанном и стимулированном, что позволило оценить не только спонтанную активность полиморфноядерных лейкоцитов, но и способность их стимулироваться, что не маловажно в диагностике первичных и вторичных иммунодефицитов.

Реактивы и их приготовление.

НСТ – 9 мг порошка растворяют в 12 мл дистиллированной воды. Пирогенал – 1 мл пирогенала (25 мг/мл) разводят в 3 мл физ. раствора. Спирт-формалин (1 часть 40% формалина + 9 частей 96% спирта) используется в качестве фиксатора. Нейтральный красный – 100 мг растворяют в 100 мл физ.раствора.

Постановка реакции.

1. В конические пробирки (1,2) добавляют

1) 0,1 мл физ. раствора и 0,1 мл крови с гепарином, перемешать

2) 1 мл пирогенала и 0,1 мл крови с гепарином, перемешать

2. Инкубировать 30 минут при 37˚С

3. В каждую пробирку добавить 0,1 мл НСТ

4. Инкубировать 10 минут при 37˚С

5. Добавить 0,2 мл 20% раствора формалина

6. Через 3 минуты добавить 3 мл дистиллированной воды и в течение 20 секунд интенсивно перемешать

7. Добавить 1 мл 3,4% NaCl

8. Отцентрифугировать 15 минут при 1500об/мин

9. Надосадок слить, из осадка сделать мазок на предметном стекле

10. Мазок высушить на воздухе, зафиксировать смесью спирт-формалин в течение 30 минут, промыть дистиллированной водой, окрасить нейтральным красным в течение 35-45 минут, промыть дистиллированной водой.

Учет реакции проводится при подсчете 100 нейтрофилов.

Вычисляли % клеток, содержащих включения диформазана в виде гранул или сплошных отложений.

А так же вычисляли индекс стимуляции.

ИС =	% положительных клеток в индуцированном НСТ-тесте
% положительных клеток в спонтанном НСТ-тесте