Гомогенный ИФАГомогенные методы ИФА характеризуются тем, что все иммунохимические и ферментативные реакции происходят в однофазной системе (в растворе) и не требуют механического разделения и удаления промежуточных продуктов и непрореагировавших компонентов. В основе гомогенного ИФА лежит ингибирование активности фермента при его соединении с антигеном и восстановление ее в результате реакции антиген – антитело или же, наоборот, потеря активности фермента в результате реакции. Необходимым условием гомогенного ИФА является изменение наблюдаемой активности фермента при взаимодействии меченого антигена с антителом. Основанный на этом принципе гомогенный ИФА получил в литературе название EMIT – анализ или иммуноаналитический метод с регуляцией ферментатавной активности (от англ. e nzyme m ultiplied immunoassay t echniqje). Конъюгат Аг-Е, подобно свободному ферменту, катализирует превращение субстрата S в продукт реакции P, а комплекс Ат–Аг-Е не проявляет ферментативной активности:
Потеря активности может быть вызвана изменением конформации молекулы фермента и нарушением структуры его активного центра, а также пространственной недоступностью активного центра вследствие присоединения антитела. Если теперь добавить свободный антиген, то он, конкурируя за антитело, вызовет регенерацию конъюгата Аг-Е и появление ферментативной активности. Схема гомогенного анализа довольно проста: меченые ферментом антигены (конъюгаты) конкурируют с антигенами анализируемой пробы за связывание с антителами, количество которых ограничено. Все компоненты находятся в жидкой фазе или в растворе. Чем больше антигена в анализируемом образце, тем больше его свяжется с антителами и тем больше конъюгата (меченых ферментом антигенов) останется в растворе несвязанным и проявит ферментативную активность по отношению к субстрату, изменяя цвет раствора. Таким образом, ферментативная активность конъюгата прямо пропорциональна количеству свободного антигена в исследуемой пробе. При отсутствии же в исследуемом растворе анализируемого антигена конъюгат этого антигена с ферментом свяжется с соответствующими антителами, и входящий в комплекс Ат–Аг-Е фермент потеряет или существенно снизит свою каталитическую активность. При наличии калибровочной кривой, отражающей зависимость между концентрацией Аг и ферментативной активностью конъюгата Аг-Е, можно определить концентрацию антигена в исследуемом образце. Существенным достоинством гомогенного ИФА является экспрессность определения, которая составляет 2 – 5 минут. В настоящее время налажен промышленный выпуск различных тест-систем для быстрого выявления токсинов, стероидных гормонов, гаптенов, лекарственных соединений в биологических жидкостях. К недостаткам следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл).
|
