Студопедия — Принцип метода. В теоретическом приложении к лабораторной работе №5 было указано, что скорости ферментативных реакций рассчитывают либо по убыли исходных веществ
Студопедия Главная Случайная страница Обратная связь

Разделы: Автомобили Астрономия Биология География Дом и сад Другие языки Другое Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Металлургия Механика Образование Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Туризм Физика Философия Финансы Химия Черчение Экология Экономика Электроника

Принцип метода. В теоретическом приложении к лабораторной работе №5 было указано, что скорости ферментативных реакций рассчитывают либо по убыли исходных веществ






В теоретическом приложении к лабораторной работе №5 было указано, что скорости ферментативных реакций рассчитывают либо по убыли исходных веществ, т.е. субстратов, подвергающихся каталитическому воздействию, либо по образованию и накоплению продуктов реакции в единицу времени. Одним из примеров реакций, часто используемых в лабораторных практикумах для определения кинетических параметров, является реакция гидролиза крахмала под действием амилазы слюны. Следует, однако, помнить, что корректное определение главных кинетических параметров ферментативных реакций – константы Михаэлиса, КM, и максимальной скорости, V max, возможно только в условиях начальной стадии процесса, когда концентрация субстрата велика и практически соответствует его исходному коли­честву, фермент находится в состоянии насыщения и, следовательно, скорость реакции пропорциональна концентрации фермент-субстратного комплекса [ ES ]. Вполне понятно, что при высокой концентрации субстрата, как это имеет место в случае гидролиза крахмала, следить за начальной скоростью реакции по его убыли затруднительно. Поэтому наиболее грамотно определять начальную скорость процесса не по убыли субстрата, а по накоплению продукта реакции.

Исходя из сказанного выше, удобной системой для расчета КM и V max в условиях in vitro может быть ацетилхолинэстераза мембран теней эритроцитов, которая катализирует реакцию гидролиза сложноэфирной связи в ацетилхолине с образованием холина и ацетата:

 

 

В ферментативной кинетике успех определения кинетических параметров зависит не только от выбранной ферментной системы, но и от чувствительности и адекватности метода анализа продукта или продуктов реакции. В нашем случае в качестве субстрата ацетилхолинэстеразы целесообразно использовать не ацетилхолин, а его аналог – ацетилтиохолин:

 

 

Главная идея использования ацетилтиохолина в качестве субстрата ацетилхолинэстеразы заключается в том, что в результате гидролиза тиоэфирной связи в этом субстрате один из продуктов реакции – тиохолин содержит сульфгидрильную группу:

 

 

Накапливающийся тиохолин взаимодействует с 5, 5'-дитиобис[2-нитробензойной кислотой] (реактив Эллмана) с образованием 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты, которая окрашена в желтый цвет, причем интенсивность окраски пропорциональна содержанию в реакционной смеси 2-нитро-5-меркаптобензойной кислоты и, следовательно, тиохолина.

Приведенные выше рассуждения позволяют сделать вывод о том, что система ацетилхолинэстераза-ацетилтиохолин является во всех отношениях удобной не только для расчета значений КM и V max реакции гидролиза ацетилтиохолина, но позволит также определить значение константы ингибирования этой реакции, КI, при использовании в качестве ингибитора естественного субстрата ацетилхолинэстеразы – ацетилхолина.

 

Контрольные вопросы

1. Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативных реакций

2. Уравнение Михаэлиса–Ментен. Уравнение Лайнуивера-Берка

3. Графическое определение величины константы Михаэлиса

4. Типы ингибирования активности ферментов. Графическое определение величин констант Михаэлиса в отсутствие и в присутствии ингибиторов

5. Принцип метода определения кинетических параметров реакции гидролиза сложноэфирной связи под действием ацетилхолинэстеразы

 

Литература

1. Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 1, «Мир», М., 1982

2. Диксон М., Уэбб Э., Ферменты, т. 2, «Мир», М., 1982

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В., Биохимия человека, т. 1, «Мир», М., 1993

4. Горячковский А.М., Справочное пособие по клинической биохимии, ОКФА, Одесса, 1994

5. Степанов В.М., Молекулярная биология: структура и функции белков, под ред. академика Спирина А.С., «Высшая школа», М., 1996

6. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д., Биологическая химия, «Высшая школа», М., 1998

7. Кольман Я., Рем К.-Г., Наглядная биохимия, «Мир», М., 2000

8. Северин Е.С., Биохимия, «Гэотар-мед», М., 2004.

9. Комов В.П., Биохимия, М.: Дрофа, 2004.

10. Чиркин А.А., Практикум по биохимии, «Новое знание», Минск, 2002.

11. Кухта В.К., Морозкина Т.С., Олецкий Э.И., Таганович А.Д., Биологическая химия, «Бином», М., 2008.

12. Чиркин А.А., Данченко Е.О., Биохимия, «Медицинская литература», М., 2010.

Дополнительная литература

1. Nelson D.L., Cox M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2004.

2. Metzler D., Biochemistry, (The chemical reactions in living cells), Elsevier, Academic Press, V. 1-2, 2003-2004.

3. Berg J.M., Tymoczko J.L., Lubert Stryer, Biochemistry, W.H. Freeman (ed.), 2006.

 

 

Ход работы

 

Цель работы: Определение кинетических параметров ферментативных реакций. Регуляция активности ферментов
   
Задание I Определить значения KM и V max реакции гидролиза крахмала под действием бактериальной амилазы

 







Дата добавления: 2014-11-10; просмотров: 731. Нарушение авторских прав; Мы поможем в написании вашей работы!



Шрифт зодчего Шрифт зодчего состоит из прописных (заглавных), строчных букв и цифр...

Картограммы и картодиаграммы Картограммы и картодиаграммы применяются для изображения географической характеристики изучаемых явлений...

Практические расчеты на срез и смятие При изучении темы обратите внимание на основные расчетные предпосылки и условности расчета...

Функция спроса населения на данный товар Функция спроса населения на данный товар: Qd=7-Р. Функция предложения: Qs= -5+2Р,где...

СИНТАКСИЧЕСКАЯ РАБОТА В СИСТЕМЕ РАЗВИТИЯ РЕЧИ УЧАЩИХСЯ В языке различаются уровни — уровень слова (лексический), уровень словосочетания и предложения (синтаксический) и уровень Словосочетание в этом смысле может рассматриваться как переходное звено от лексического уровня к синтаксическому...

Плейотропное действие генов. Примеры. Плейотропное действие генов - это зависимость нескольких признаков от одного гена, то есть множественное действие одного гена...

Методика обучения письму и письменной речи на иностранном языке в средней школе. Различают письмо и письменную речь. Письмо – объект овладения графической и орфографической системами иностранного языка для фиксации языкового и речевого материала...

Предпосылки, условия и движущие силы психического развития Предпосылки –это факторы. Факторы психического развития –это ведущие детерминанты развития чел. К ним относят: среду...

Анализ микросреды предприятия Анализ микросреды направлен на анализ состояния тех со­ставляющих внешней среды, с которыми предприятие нахо­дится в непосредственном взаимодействии...

Типы конфликтных личностей (Дж. Скотт) Дж. Г. Скотт опирается на типологию Р. М. Брансом, но дополняет её. Они убеждены в своей абсолютной правоте и хотят, чтобы...

Studopedia.info - Студопедия - 2014-2024 год . (0.007 сек.) русская версия | украинская версия