Определение кинетических параметров, KM и Vmax, реакции гидролиза крахмала под действием бактериальной амилазы

1. В 5 пробирок вносят по 1 мл препарата амилазы слюны. Затем в каждую добавляют по 1 мл воды.

2. Пробирки инкубируют в термостате 38°С в течение 1 мин.

3. Последовательно, точно отметив начальное время реакции, в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала в концентрации, указанной в таблице:

 

 

№ пробирки
Концентрация крахмала, мМ			0, 5	0, 25	0, 125

 

4. В каждую пробирку добавляют 200 мкл раствора I₂ в KI (реактива Люголя). Пробы инкубируют в течение 10 мин.

5. Определяют оптическую плотность при l=620 нм. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:

 

 

№ пробирки	Концентрация крахмала, мМ	А620
	0, 5
	0, 25
	0, 125

 

6. Строят график зависимости V_отн от [ S ]. По графику Лайнуивера-Берка определяют значение К_M

 

Влияние активаторов и ингибиторов на кинетические параметры бактериальной амилазы

1. В 10 пробирок вносят по 1 мл раствора фермента.

2. В первые 5 пробирок (серия № 1) добавляют по 1 мл 1 % раствора NaCl, в оставшиеся (серия № 2) - по 1 мл 2 % раствора CuSO₄.

3. Пробирки инкубируют в термостате при 38°С в течение 1 мин.

4. Добавление 1 мл субстрата в указанной в таблице концентрации (см. предыдущее задание) проводят попарно в каждую серию пробирок, например, через 2 мин.

5. В каждую пробирку добавляют 200 мкл раствора I₂ в KI. Пробы инкубируют в течение 10 мин.

6. Проводят фотометрирование образцов при l=620 нм. Полученные результаты представляют в виде следующей таблицы:

 

№ пробирки	А620
Серия №1 (без ингибитора)	Серия №2 (с ингибитором)

 

7. Строят график зависимости V_отн от [ S ] для первой (с NaCl) и второй (с СuSO₄) серий проб. Рассчитывают K_M и V _max для скорости реакции расщепления крахмала в отсутствии и присутствии ингибитора, пользуясь графиком Лайнуивера-Берка.

 

Задание II

Определить кинетические параметры KM и V max реакции гидролитического расщепления ацетил тио холина с участием холинэстеразы и характер ингибирующего действия ацетилхолина на гидролиз ацетил тио холина под действием холинэстеразы мембран теней эритроцитов

 

* Приготовление калий-фосфатного буферного раствора

2. В 100 мл стакан вносят 13, 61 г КН₂РО₄, добавляют дистиллированной воды до отметки 70 мл и ставят на магнитную мешалку до полного растворения.

3. Доводят до значения рН 8, 0 раствором гидроксида калия, а затем доводят до метки 100 мл дистиллированной водой.

 

* Приготовление раствора субстрата холинэстеразы (ацетилтиохолина йодида)

1. Для приготовления 0, 075 М раствора растворяют 0, 22 г ацетилтиохолин йодида в 10 мл дистиллированной воды. Держать на холоду!