Занятие № 35

 

ТЕМА. БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КРОВИ И МОЧИ

ПО УРГЕНТНЫМ ПОКАЗАТЕЛЯМ. РАБОТА В

ПЛАНЕ УИРС.

 

Цель занятия: 1.Ознакомиться с методами экспресс-диагностики отдельных компонентов сыворотки крови и мочи.

2.Приобрести навык комплексного исследования биопроб.

Исходный уровень знаний:

- химический состав крови;

- химический состав мочи.

Содержание занятия.

I.2. Небелковые азотистые компоненты крови.

Безазотистые органические компоненты крови.

Органические и минеральные компоненты мочи.

Патологические компоненты мочи.

II.1.Работа № 1. ИССЛЕДОВАНИЕ МОЧИ С ПОМОЩЬЮ

"pentaPHAN".

Диагностические полоски "pentaPHAN"("пентаФАН") имеют пять зон индикации, наклеенных на полимерную подложку. Реакции зон основаны на следующих принципах:

- кетоны (белый, с кремовым оттенком квадратик) - зона содержит щелочной нитропруссид, дающий с ацетоуксусной кислотой и ацетоном розовое, до темно-фиолетового окрашивание;

- восстанавливающие вещества (светло-желтый квадратик) - зона содержит кислотный буфер в смеси с фосфорномолибденовой кислотой, которая под действием сильных восстановителей (главным образом, аскорбиновой и гентизиновой кислот) превращается в молибденовый синий;

- глюкоза (ярко-желтый квадратик) - зона содержит ферменты глюкозооксидазу и пероксидазу, а также хромогенную систему, которая в присутствии глюкозы окисляется с образованием зеленых и даже синих продуктов;

- белок (светлый серо-зеленый квадратик) - зона содержит кислотный буфер в смеси со специальным индикатором, изменяющим свою окраску в присутствии белков от желтой через зеленую до синей;

- рН (оранжево-красный квадратик) - зона содержит смешанный кислотно-основной индикатор с переходом красной окраски через желтую и зеленую в синюю в интервале рН 5-9.

Порядок выполнения работы.

Полоску погрузить в исследуемую мочу и немедленно вынуть. Непосредственно после погружения полоски отсчитать величину рН, сравнив зоны индикации для рН с соответствующей цветной шкалой.

Примерно через 30 с после погружения аналогично оценить пробу на восстанавливающие в-ва: если последние содержатся в моче в незначительном количестве (цвет квадратика как "1" на эталоне), в течение 30-60 с оценить тест на глюкозу; если содержание восстанавливающих в-в в пределах "1"-"2", количество глюкозы определить через 1-2 мин после погружения; при содержании восстанавливающих в-в свыше "2" нельзя дать надежную оценку пробы на глюкозу, в этом случае надо повторить пробу не ранее чем через 10 час после последнего приема аскорбиновой кислоты.

Пробы на белок и кетоны оценить спустя 1 мин после обмакивания полоски.

Количественная оценка:

Показатели	«0»	«1»	«2»	«3»	«4»
Кетоны (ммоль/л)	<0,3	1,5	2,9	7,3	>14,7
Восстанавл. в-ва (мг/л)	<30				>600
Глюкоза (ммоль/л)	<1,3	2,78	5,55	16,7	>83,3
Белок (г/л)	<0,1	0,3	1,0	3,0	>10,0
рН

 

РЕЗУЛЬТАТЫ:

 

ВЫВОД:

 

 

Работа № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЧЕВИНЫ В КРОВИ С

ПО­МОЩЬЮ "УРЕАТЕСТ".

Реактивная бумага "Уреатест" применяется для экспресс-определения содержания мочевины в сыворотке крови и представляет собой полоски хроматографической бумаги размером 120х10 мм, пропитанные растворами фермента и индикатора. Зоны их нанесения разделены красной парафиновой полосой. При определении полоску следует держать за свободный конец.

 

 

- непропитанный конец бумаги

- парафиновая полоска

 

 

- красная парафиновая полоска

 

- зона фермента (место нанесения сыворотки

крови)

 

Принцип метода.

Метод основан на специфическом действии фермента уреазы расщеплять мочевину с выделением аммиака. Выделившийся аммиак окрашивает индикатор в голубой цвет. Высота окрашенной зоны в мм пропорциональна концентрации мочевины в мг%, что определяется по кривой на графике. Пределы определения - от 20 до 250 мг%.

мм

50

 

40

 

30

 

20

 

10

30 60 90 120 150 180 210 240 мг%

 

Порядок выполнения работы.

Сыворотку крови развести дистиллированной водой 1:1. На конец бумажки, пропитанный ферментом, на расстоянии 3 мм от красной парафиновой полосы мерной пипеткой нанести 0,03 см³ разведенной сыворотки крови. Быстро внести полоску в чистую сухую пробирку, плотно закрыть пробкой и оставить на 20 мин при 37⁰С в термостате или на 30 мин при 20⁰С.

Измерить высоту индикаторной зоны, окрашенной в голубой цвет.

По приложенному графику (см. выше) найти содержание мочевины в мг%, соответствующее результатам измерения в мм.

В случае использования крови или неразбавленной сыворотки крови результат надо делить на 2.

РЕЗУЛЬТАТ:

 

ВЫВОД:

 

Работа № 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ МОЧИ С ПО-­

МО­ЩЬЮ "ГЛЮКОТЕСТ".

Порядок выполнения работы.

Полностью смочить в моче желтую полоску реактивной бумаги. Поместить бумажку на пластмассовую пластинку и выдержать около 2 мин. (По истечении 6 месяцев со дня выпуска длительность выдержки увеличить на 5-1О мин). Сравнить изменившуюся окраску желтой полоски с цветной шкалой.

Примечания. Для исследования использовать свеженабранную мочу, взятую до приема пищи.

На точность анализа отрицательно влияет присутствие в моче аскорбиновой кислоты.

Не дотрагиваться пальцами до желтой полоски реактивной бумаги.

Беречь от солнечных лучей и влаги!

РЕЗУЛЬТАТ:

 

ВЫВОД:

 

 

Работа № 4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕ­-

МО­ГЛОБИНА, РАСТВОРЕННОГО В

ПЛАЗ­МЕ КРОВИ.

Принцип метода и химизм реакции см. на стр.93.

Порядок выполнения работы.

Реактивы (мл)	Опыт. (пробирка)	Контроль (пробирка)
Ацетатный буфер рН 4,6	4,0	4,0
0,3% р-р перекиси водорода	2,0	2,0
0,1% р-р бензидина	2,0	2,0
Плазма крови	0,04	-
Физиологический р-р	-	0,04

Через 3 мин растворы перелить в кюветы 10мм и фотометрировать при красном светофильтре (680 нм).

При наличии гемоглобина (т.е. при гемолизе) интенсивность голубой окраски нарастает в течение 4-5 мин, поэтому величину оптической плотности измеряют 2 раза и регистрируют максимальные показания. Спустя 5-6 мин после фотометрирования окраска приобретает лилово-буроватый оттенок и величина оптической плотности уменьшается.

Количество растворенного гемоглобина (в мг%) определяют по калибровочной кривой, построенной на основании величин оптической плотности, полученных при фотометрировании растворов с точно известным содержанием гемоглобина (калибровочная кривая приготовлена заранее).

РЕЗУЛЬТАТ:

 

ВЫВОД:

 

 

Клинико-диагностическое значение.

В норме в плазме крови содержатся следы растворенного гемоглобина в пределах 0,2-2,5 мг%.

Повышенное количество растворенного в плазме гемоглобина является признаком внутрисосудистого гемолиза эритроцитов. При воздействии некоторых промышленных токсических веществ на организм человека можно ожидать появления внутрисосудистого гемолиза. Так, например, при острой интоксикации анилином наблюдается увеличение количества растворенного в плазме крови гемоглобина до 5,7 мг%.

 

Работа в плане УИРС.

Студент получает пробирку с клиническим материалом (мочой) и анализирует содержимое на наличие белка, ацетона, крови и сахара.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

 

ВЫВОД:

 

III.2. Контрольные вопросы.

Сколько в норме содержится гемоглобина в плазме крови?

Какие факторы влияют на уровень растворенного в плазме гемоглобина?

Сколько в норме содержится мочевины в сыворотке крови?

Когда появляется глюкозурия?

Когда отмечается протеинурия?

Когда появляется гематурия?

Когда отмечается ацетонурия?

Материал для самоподготовки. а)1 с.567-585, 608-

624.

II, III