Проведение эксперимента

При исследовании кинетики пероксидазного окисления йодид-ионов за ходом реакции наблюдают по изменению концентрации образующегося йода, измеряемой спектрофотометрически при длине волны l = 400 нм.

Реакцию проводят непосредственно в кювете измерительного прибора-спектрофотометра. Объем реакционной смеси постоянен во всех измерениях и составляет 4 мл.

Перед началом опыта в соответствии с инструкцией к измерительному прибору проводят подготовительные операции, необходимые для измерения оптической плотности исследуемых растворов.

В кювету заливают буферный раствор, заданные объемы растворов йодистого калия и пероксидазы и помещают ее в кюветное отделение спектрофотометра (фотоколориметра). Ферментативную реакцию начинают внесением с помощью дозатора необходимого объема пероксида водорода.

Измерения оптической плотности реакционной смеси проводят в соответствии с инструкцией к используемому измерительному прибору. Продолжительность опыта 5 – 10 минут. Затем кювету промывают водой и заливают в нее новые растворы для следующего опыта. Опыты проводят при пяти различных концентрациях субстрата (KI или H₂O₂) и постоянной концентрации второго субстрата.

Для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по йодиду калия необходимо провести измерение начальной скорости пероксидазной реакции с различными концентрациями йодида калия при постоянной концентрации второго субстрата – пероксида водорода и фермента. Состав растворов приведен в таблице III.1.

Растворы готовить, сливая реагенты в следующей последовательности:

!	1) KI, затем 2) ацетатный буфер, затем 3) пероксидаза, затем 4) H2O2 .

Таблица III.1. Состав растворов для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по йодиду калия

1)Объём KI (6×10–2 М), мл	2)Объём ацетатного буфера (pH = 4.6), мл
0.1	3.3
0.2	3.2
0.3	3.1
0.5	2.9
1.0	2.4
1.5	1.9
3)Объём пероксидазы = 0,1 мл 4)Объём H2O2 (4×10–3 М) = 0,5 мл

 

Для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по пероксиду водорода необходимо провести измерение начальной скорости реакции с различными начальными концентрациями пероксида водорода при постоянстве концентрации KI. Состав растворов приведен в таблице III.2. Последовательность сливания реагентов та же.

 

Таблица III.2. Состав растворов для определения эффективных значений константы Михаэлиса и максимальной скорости по H₂O₂.

1)Объём KI (6×10–2 М) = 1,5 мл 3)Объём пероксидазы = 0,1 мл
2)Объём ацетатного буфера (pH = 4.6), мл	4)Объём H2O2 (4×10–3 М), мл
2.3	0.1
2.2	0.2
2.1	0.3
1.9	0.5
1.6	0.8
1.4	1.0

 

Для определения истинной константы скорости () одной из стадий пероксидазной реакции (схема III.5) необходимо определить эффективные константы Михаэлиса по пероксиду водорода при разных начальных концентрациях второго субстрата – KI. Состав реакционных смесей для проведения опытов приведен в приложении в таблице III.7.