А н я т и е 29. ПОДСЧЕТ ЭРИТРОЦИТОВ, ЛЕЙКОЦИТОВ И ТРОМБОЦИТОВ КРОВИ

Цель работы. Освоить методику подсчета эритроцитов, лейкоцитов и тромбо­цитов.

Объекты исследования и оборудование. Кровь с антикоагулянтом, вата.

Микроскопы, счетные камеры Горяева, шлифованные покровные стекла, ме­ланжеры для эритроцитов и лейкоцитов, лабораторные пробирки с пробками, градуированные пипетки на 1 и 5л, пипетки от гемометра Сали.

0, 85%-й раствор хлорида натрия, жидкость Тюрка, раствор трилона Б (три-лон Б — 50 г, 35...40%-й раствор формальдегида — 50 мл, дистиллированная вода — 450 мл), 2%-й раствор сапонина, 4%-й раствор гипсофилина.

Количество форменных элементов крови определяют с помо­щью счетных камер либо электронных счетчиков частиц. Эритро­циты можно также подсчитать фотоэлектроколориметрическим методом.

Определение количества форменных элементов в счетной камере. I Ірименяют различные счетные камеры — Горяева, Тома—Цейса, Ьюркера, Тюрка, Предтеченского, Цапперт, Фукса—Розенталя, 'Іпьцхольца, Неубауера и др. В нашей стране чаще пользуются счетной камерой Горяева (рис. 7.5), которая представляет собой толстое предметное стекло с четырьмя поперечными желобками, между которыми расположены три полосы. Средняя полоса на 0, 1 мм ниже боковых и разделена продольным желобком на две

 

Рис. 7.5. Оборудование для подсчета форменных элементов крови:

А — счетная камера Горяева: / — вид сверху; 2 — вид сбоку; 3 — сетка Горяева (а — малый и б—большой квадраты); Б — смесители (меланжеры): 1 — эритроцитарный; 2— лейкоцитарный

равные половины, на каждой из которых выгравирована сетка Го­ряева. Когда на поперечные полосы кладут шлифованное покров­ное стекло и притирают его до образования интерференционных цветных кругов («кольца Ньютона»), над средней полосой остает­ся щелевидное пространство (камера) высотой 0, 1 мм.

Площадь камеры 9 мм² (3x3 мм); сетка Горяева состоит из 225 больших квадратов, 25 из них разделены на 16 малень­ких квадратиков. Площадь маленького квадратика составляет 1/400 мм² (1/20 х 1, 20 мм), а объем камеры над ними 1/4000 мкл (1/400 мм² х 1, 10 мм).

Подсчет эритроцитов. Чтобы подсчитать клетки, кровь раз­водят жидкостью — разбавителем. Используют эритроцитарный меланжер (смеситель) или чаще пробирку (пробирочный метод по Н. М. Николаеву, 1954).

В меланжер сначала набирают кровь до метки «0, 5», кончик капилляра протирают ваткой, а затем до метки «101»— разбав­ляющую жидкость, которая представляет собой 0, 85%-й или 3%-й раствор хлорида натрия; 5%-й раствор цитрата натрия или ра­створ йода (йод кристаллический 0, 3 г, йоид калия 0, 4 г, цитрат натрия 2 г, дистиллированная вода 100 мл). Меланжер закрывают с обеих сторон большим и указательным пальцами и встряхива­ют 1...2мин. В данном случае получается разведение 1: 200. Из

 

О

TJ7

-Q-

DP

меланжера вначале удаляют на ватку первые 3 капли разведенной крови, а следующей заряжают камеру — наносят каплю на среднюю полоску камеры у края притертого покровного стекла. Капля попадает под стекло в щелевид­ное пространство и заполняет камеру.

XT

-о-

|0б-

Рис. 7.6. Схема подсчета эри­троцитов в большом квадрате счетной камеры Горяева

В пробирку сначала вносят 4 мл 0, 85%-го или 3%-го раствора хлори­да натрия, а затем добавляют 0, 02 мл крови пипеткой от гемометра Сали и смешивают. Пастеровской пипет­кой набирают разбавленную кровь (разведение 1: 200) и заряжают счет­ную камеру.

Эритроциты подсчитывают через 2

3 мин после заполнения камеры под микроскопом (объектив х8, окуляр х 15) при затем­ненном поле (прикрывают диафрагму или опускают конденсор) в левом верхнем большом квадрате (разделенном на 16 маленьких квадратиков), а затем еще в 4 больших квадратах, расположенных по диагонали или по краям сетки в 4 квадратах и одном в центре (всего в 5 больших квадратах).

Подсчет клеток в большом квадрате начинают с левого верхне­го маленького квадратика и продолжают во втором, третьем и чет­вертом квадратиках, расположенных справа от первого (рис. 7.6). Подсчитав эритроциты в верхнем ряду, переходят на нижераспо­ложенный ряд, начиная считать в первом правом квадратике, и т. д. Подсчитывают все эритроциты, которые лежат внутри маленьких квадратиков, а также на верхней и левой сторонах большого квад­рата; клетки, расположенные на нижней и правой сторонах, не учитывают.

Количество эритроцитов определяют по одной из формул

Х_ЭІ=АБ/ВГ= А • 10 000, Х_э2 =А ■ 10¹⁰,

Где Х_эі — количество эритроцитов в 1 мкл крови; Х_Л — количество эритроцитов в I л крови; А — число эритроцитов в 5 больших квадратах; Б — степень разведения крови (200); В — число маленьких квадратиков в 5 больших квадратах (16 ■ 5 = 80); /'—объем счетной камеры над маленьким квадратиком (1/4000мкл).

Подсчет лейкоцитов. Кровь можно разводить как в лейкоци­тарном меланжере, так и в пробирке.

В меланжер набирают кровь до метки «0, 5», а затем до метки «11»— жидкость Тюрка (3%-й раствор уксусной кислоты — 100 мл, I %-й раствор генциана фиолетового или метиленового синего — I мл). Встряхивают 1...2мин. Уксусная кислота гемолизирует эри­троциты, а генциан фиолетовый или метиленовый синий окраши-

 

вают лейкоциты. Получают при этом разведение 1: 20. Выпускают 3 капли на ватку (или фильтровальную бумагу), а следующей кап­лей заряжают счетную камеру.

В пробирку вносят 0, 4 мл жидкости Тюрка и 0, 02 мл крови, ко­торую набирают пипеткой от гемометра Сали (разведение 1: 20); тщательно перемешивают. Смесь отбирают пастеровской пипет­кой и заряжают счетную камеру. Через 2...3 мин, когда лейкоциты осядут на дно камеры, начинают подсчитывать клетки под мик­роскопом (объектив х8, окуляр х 15) при затемненном поле в 100 больших квадратах, не имеющих дополнительных линий и расположенных по всей площади сетки Горяева группами по че­тыре квадрата.

Количество лейкоцитов определяют по формуле

Х_Л = АБ/ВГ = А- 50,

где.Уд — количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А — число лейкоцитов в 100 боль­ших квадратах; Б — степень разведения крови (20); 5 —число маленьких квадра­тиков в 100 больших квадратах (100 ■ 16 = 1600); Г— объем счетной камеры над ма­леньким квадратиком (1/4000 мкл).

Для пересчета на 1 л крови используют формулу Х_п = А ■ 5 • 10⁷.

Подсчет тромбоцитов (по Хауке). В шприц на 1 мл набирают 0, 5 мл 1%-го раствора трилона Б и 0, 5 мл венозной крови, переме­шивают (разведение 1: 1) и сразу переносят в селиконированную пробирку, которую закрывают пробкой. (Кровь в пробирке может находиться несколько часов.). Перед подсчетом содержимое про­бирки перемешивают и набирают в лейкоцитарный меланжер до метки «1», а до метки «11» — 1%-й раствор оксалата аммония (раз­ведение крови 1: 20). Тщательно перемешивают и выдерживают 20 мин (для гемолиза эритроцитов). Затем меланжер встряхивают 2...3 мин, выпускают на ватку 3 капли смеси, а следующей заря­жают счетную камеру, которую ставят на 10 мин во влажную ка­меру (чашка Петри с ваткой, смоченной водой), чтобы тромбоци­ты осели на дно камеры. Тромбоциты подсчитывают в 5 больших квадратах, разделенных на 16 маленьких квадратиков (объектив х 40, окуляр х 7; синий светофильтр).

Количество тромбоцитов определяют по формуле

Х_Г = АБ/ВГ=А-\000,

где Х_Т — количество тромбоцитов в 1 мкл крови; А — число тромбоцитов в 5 боль­ших квадратах; Б — степень разведения крови (20); 5 —число маленьких квадра­тиков в 5 больших квадратах (80); Г— объем счетной камеры над маленьким квад­ратиком (1/4000 мкл).

Для пересчета на 1 л крови используют формулу Х_т = А • 10⁹. Определение количества эритроцитов и лейкоцитов с помощью кондуктометрических счетчиков. Для подсчета клеток использу-

 

ют отечественные приборы типа СФЭК-Ц-04 (рис. 7.7), ЦМК-1, ЦМК-2, а также импортные — «Целлоскоп» (Швеция), «Культер» (Фран­ция), «Пикоскель» (Венг­рия). Созданы автоматичес­кие линии, где кровь быст­ро и точно исследуют сра­зу по нескольким пара­метрам («Техникой» модели SMA-4, SMA-7, Hemalog D, «Культер» модель S, S-Plus, Diff-З и др.).

Рис. 7.7. Счетчик форменных элементов кро­ви кондуктометрический (СФЭК-Ц-04): / — табло для высвечивания цифр; 2— рычаг вклю­чения; 3 — стаканчик со взвесью клеток

Принцип работы кондук-тометрического счетчика (рис. 7.8). Перед работой стеклянную канюлю 4 по­мещают в стаканчик 5, со­держащий взвесь клеток

крови в электролите, и нажимают на пусковой рычаг 9. В этот момент в полости канюли создается разрежение, под действием которого суспензия клеток крови поступает из стаканчика через микроотверстие 6 в канюлю. Через наружный и внутренний элек­троды 3 и микроотверстие начинает проходить постоянный элек-

Рис. 7.8. Схема устройства кондуктометрического счетчика:

/ — насос; 2 — электромагнитный клапан; 3 — электроды; 4 — канюля датчика; 5—стаканчик I пробой; б—микроотверстие; 7—груз; 8— постоянный магнит; 9— пусковой рычаг; 10—

геркон; 11 — электромагнит

трический ток. Эритроциты и лейкоциты практически не обла­дают электропроводностью, поэтому, когда они продвигаются че­рез микроотверстие канюли, сопротивление датчика увеличива­ется, вследствие чего возникают импульсы напряжения, подавае­мые на усилитель.

Когда пусковой рычаг находится в нижнем положении, по­стоянный магнит 8, установленный на рычаге, замыкает контакты геркона 10. При этом включается электромагнит //, удерживаю­щий груз 7в поднятом положении. Через 7 с после того, как взвесь клеток начинает всасываться в канюлю, микроЭВМ включает на 0, 5 с электромагнитный клапан 2, соединяющий полость канюли с атмосферой. Всасывание прекращается. Еще через 0, 5 с включа­ется электромагнит, а груз опускается, создавая с помощью насо­са 1 давление в полости канюли- Под этим давлением взвесь кле­ток через микроотверстие выбрасывается обратно в стакан. Благо­даря грузу обеспечивается постоянство расхода суспензии через микроотверстие. Одновременно включается счетчик — устрой­ство, регистрирующее электрические импульсы, исходящие от форменных элементов крови. Через 7 с счетчик выключается и ре­зультаты выводятся на цифровое табло.

Подсчет эритроцитов и лейкоцитов на приборе СФЭК-Ц-04. При подсчете эритроцитов в пробирку набирают 5 мл профильт­рованного физиологического раствора и вносят 0, 02 мл крови, стабилизированной трилоном Б (разведение 1: 250). В стаканчик отмеривают 10 мл физиологического раствора и добавляют 0, 05 мл смеси из пробирки, получая рабочее разведение крови 1: 50 000, которое используют для подсчета эритроцитов. На столик уста­навливают стаканчик с исследуемой суспензией и поднимают сто­лик до упора так, чтобы, наружный электрод и канюля оказались в стаканчике. Нажимают кнопку «Э» на лицевой панели и переме­щают спусковой рычаг вниз до упора. Когда процесс подсчета за­вершится, записывают показания табло. Подсчет сопровождается звуковыми сигналами, частота которых пропорциональна концен­трации форменных элементов.

При подсчете лейкоцитов в пробирку, содержащую кровь в раз­ведении 1: 250 (после того как из пробирки отобрали 0, 05 мл для подсчета эритроцитов), вносят 5 мл физиологического раствора. Получается разведение крови 1: 500. К смеси прибавляют 0, 1 мл 4%-го раствора гипсофилина или 2%-го раствора сапонина, со­держимое пробирки перемешивают до тех пор, пока оно не станет прозрачным (гемолиз эритроцитов). Через 2...5 мин суспензия го­това для подсчета лейкоцитов. На лицевой панели прибора нажи­мают кнопку «Л», при этом загорается светодиод «Л». Приготов­ленную суспензию лейкоцитов помещают в стаканчик, который устанавливают на столик; последний поднимают до упора вверх. Пусковой рычаг перемещают вниз до упора, и когда процесс под­счета клеток завершится, записывают показания табло.

Определение количества форменных элементов у птиц (по К. С. Фо­миной и В. И. Шмельковой). Для подсчета эритроцитов в меланжер до метки «0, 5» набирают кровь, а затем до метки «101» — 0, 1%-й раствор азура II на 0, 85%-м растворе хлорида натрия (разведение 1: 200). Перемешивают встряхиванием в течение 1...2 мин, выпус­кают на ватку 3...4 капли смеси, а следующей каплей заряжают счетную камеру Горяева. Вначале подсчитывают (объектив х40, окуляр х 7) эритроциты в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали и разделенных на 16 маленьких квадратиков каждый. Эритроциты овальной формы, содержат ядра, не окрашены, круп­нее других клеток крови.

Количество эритроцитов определяют по формуле

Х_э = А-\0¹⁰,

где Х_э — количество эритроцитов в 1 л крови; А — число эритроцитов в 5 больших квадратах.

Тромбоциты овальной или веретенообразной формы, окраше­ны, хорошо контурированы; это самые мелкие клетки крови. Их подсчитывают в 100 больших квадратах.

Количество тромбоцитов определяют по формуле

Х_Т = А-5- 10⁸,

где Х_Т — количество тромбоцитов в 1 л крови; А — число тромбоцитов в 100 боль­ших квадратах.

Лейкоциты — это круглые клетки, по размеру меньше эритро­цитов, но крупнее тромбоцитов, окрашены. Их подсчитывают в 100 больших квадратах.

Количество лейкоцитов определяют по формуле

Х_л = Л-5-10⁸,

где Х„ — количество лейкоцитов в 1 л крови; А — число лейкоцитов в 100 больших квадратах.

Изменения количества форменных элементов крови. Количество эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови у здоровых жи­вотных разных видов представлено в таблице 7.2.

Увеличение количества эритроцитов — эритроцитоз (полици-темию, полиглобулию) — отмечают при потере организмом жид­кости в результате обильного потения, поносов, образования транссудатов и экссудатов (экссудативные плевриты, перитониты, водянка грудной и брюшной полостей), а также при непроходи­мости кишечника (механические илиусы), хронической альвеоляр­ной эмфиземе легких, отравлениях фосфором, диоксидом углеро­да, хлором, при декомпенсации сердца.

 

7.2. Содержание эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в крови взрослых здоро­вых животных разных видов

 

	Эритроциты,	Лейкоциты,	Тромбоциты,
Вид животного	млн/мкл	тыс/мкл	тыс/мкл
	или 107л	или Ю'/л	или Ю'/л
Крупный рогатый скот	5, 0...7, 5	4, 5.-12, 0	260.-700
Овцы	7, 0...12, 0	6, 0.-14, 0	270.-500
Козы	12, 0.-18, 0	8, 0.-17, 0	300...900
Лошади	6, 0...9, 0	7, 0.-12, 0	200...500
Свиньи	6, 0.-7, 5	8, 0.-16, 0	180.-300
Собаки	5, 2.-8, 4	8, 5.-10, 5	250...550
Куры	3, 0.-4, 0	20, 0.-40, 0	32...100

Снижение содержания эритроцитов в крови — эритропению (олигоцитемию) — наблюдают при анемиях, обусловленных недо­статочным или неполноценным кормлением (особенно при недо­статке белков, железа, меди, кобальта, марганца, витаминов С и группы В), при инфекционных заболеваниях (инфекционная ане­мия лошадей и др.), интоксикациях (вследствие длительных на-гноительных и септических процессов), отравлениях гемолити­ческими ядами, инвазионных болезнях, гемоспоридиозах (пиро­плазмоз, нутталиоз, тейлериоз, трипанозамоз и др.), лейкозах, зло­качественных новообразованиях, обильных кровопотерях.

Повышение содержания лейкоцитов в крови — лейкоцитоз — может быть:

физиологический — при беременности (незадолго до родов и сразу после них), у новорожденных (в первые дни после рожде­ния), после приема корма (наблюдают у животных с однокамер­ным желудком; у животных с многокамерным желудком и непре­рывным процессом пищеварения пищеварительного лейкоцитоза практически нет), после тяжелой физической работы (миогенный лейкоцитоз);

медикаментозный — после парентерального введения белково-содержащих и жаропонижающих препаратов, вакцин, сывороток, алкалоидов, адреналина, эфирных масел;

патологический — при лихорадочно-воспалительных процессах, многих инфекционных заболеваниях, лейкозах.

Уменьшение количества лейкоцитов — лейкопению — наблюда­ют при вирусных заболеваниях (чума свиней, инфекционный эн­цефаломиелит лошадей, повальное воспаление легких), паратифе телят, стахиботриотоксикозе, истощении защитных сил организма, лучевой болезни.

Увеличение количества кровяных пластинок в крови — тромбо-цитоз — встречается после операций, при мыте, ревматизме, артри­те, язвенном колите, остеомиелите, острой постгеморрагической и гемолитической анемиях, воспалении легких, плеврите, карци­номе, лимфогранулематозе, саркоме, миоглобинурии.

Снижение содержания тромбоцитов в крови — тромбоцитопению (тромбопению) — отмечают при большинстве острых инфекцион­ных заболеваний, геморрагических диатезах (кровопятнистая бо­лезнь, скорбут), апластических и мегалобластных анемиях, тяжелых болезнях печени, гиповитаминозе А, интоксикациях, стахиботрио­токсикозе, лейкозах (в клиническую стадию заболевания), лучевой болезни, воспалении кишечника, пироплазмозе и т. д.