Оценка и учет результатов посева диагностического материала4.5.1. Оценка результатов посева При оценке результатов культурального исследования диагностического материала необходимо соблюдать следующие правила. 1) Посевы, выполненные в течение одного дня, помещать в 2) Наблюдение за посевами и просмотр засеянных пробирок 3) При оценке результатов регистрировать следующие параметры: - появление роста — срок появления, начиная со дня посева; - интенсивность роста — число колоний; - загрязнение посева посторонней микрофлорой или грибами; - отсутствие роста. Соблюдение этих правил позволяет, во-первых, своевременно выявлять макроскопически видимый рост микобактерий или загрязняющей микрофлоры, а, во-вторых, на основании регистрации сроков появления роста и его особенностей осуществлять первичную идентификацию микобактерий. При этом необходимо иметь в виду: - появление роста кислотоустойчивых микобактерий в течение 7- - появление роста кислотоустойчивых микобактерий после 3-4 - прежде, чем дать отрицательный ответ после 12 недель При оценке результатов необходимо помнить, что используемые для посева питательные среды представляют собой обогащенный субстрат, который легко утилизируется другими микроорганизмами. Это обуславливает высокий риск загрязнения посевов различными бактериями и грибами, колонии которых визуально трудно отличить от микобактерий. Во время еженедельных просмотров посевов при подозрении на загрязнение посева гноеродной или гнилостной микрофлорой необходимо, прежде всего, удалить и уничтожить (автоклавирование, сжигание) те посевы, в которых отмечается загрязнение всей поверхности питательной среды или изменение самой питательной среды (разжижение или обесцвечивание). В ряде случаев некоторые загрязняющие посевы микроорганизмы обладают способностью разлагать составные ингредиенты среды с образованием кислоты; это приводит к снижению рН среды, высвобождению малахитового зеленого от его связей с компонентами яичной основы и изменению цвета среды на темно-зеленый. На такой среде микобактерий не растут, и такие посевы подлежат удалению. Посевы с частичным загрязнением желательно выдержать до окончания срока инкубации или до развития хотя бы нескольких колоний микобактерий, так как позднее появление загрязнения не исключает роста М. tuberculosis. В таких случаях необходимо сделать мазок культуры, окрасить его по Ziehl-Neelsen и при наличии кислотоустойчивых микобактерий попытаться обработать выросшую культуру 3-4% раствором серной кислоты, а после отмывания ее изотоническим раствором хлорида натрия вновь засеять осадок на питательные среды. Во всех случаях получения роста во избежание неверного результата и загрязнения необходимо контролировать чистоту выросшей культуры с помощью микроскопии мазка по Ziehl-Neelsen. 4.5.2. Характеристика колоний М. tuberculosis Обычно культуры микобактерий туберкулеза от впервые выявленных больных растут на плотных питательных средах в виде R- колоний (от английского слова rough — грубый, шершавый) различной величины и вида, имеют желтоватый (не желтый!) или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту. Колонии, как правило, сухие, морщинистые, но в случае диссоциации могут встречаться и влажные, слегка пигментированные колонии, розовато-желтый пигмент которых резко отличается от оранжевого или желтого пигмента сапрофитных или некоторых нетуберкулезных микобактерий. Последние обычно растут в 5-форме (от английского слова smooth-mappim). Следует отметить, что на среде Финна колонии часто выглядят более влажными, чем на среде Левенштейна-Йенсена. После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (5-формы). При культуральном исследовании ответ о выделении кислотоустойчивых микобактерий дается только после микроскопии окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из выросших колоний. При приготовлении мазков для микроскопического исследования колонии микобактерий туберкулеза проявляют свои физико-химические особенности: они не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию. Это обусловлено наличием в составе их клеточной стенки большого количества гидрофобных жиро-восковых субстанций. При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Ziehl-Neelsen, обнаруживаются яркие малиново-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами, образующие скопления или переплетения в виде "войлока" или "кос". Микобактерий туберкулеза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1—10 (чаще 1—4) мкм, шириной 0,2—0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами. Часто в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно окрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерий отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм. Если морфология колоний или микобактерий вызывает сомнения в их принадлежности к роду Mycobacterium или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом 40-45 минут. Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут сравнительно легко обесцвечиваться спиртом, так как они обладают слабой кислотоустойчивостью. В таких случаях культуры следует выдержать в термостате еще 5-10 дней и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их тинкториальных свойствах. Нетуберкулезные и авирулентные сапрофитные микобактерий могут варьировать по форме колоний и морфологии клеток. Некоторые из них грубее, толще, иногда менее интенсивно окрашены и редко образуют жгутообразные скопления. Однако некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (фотохромогенные) могут расти в виде характерной для микобактерий туберкулеза Л-форме. Многие нетуберкулезные и сапрофитные микобактерий имеют кислотоустойчивые зерна, весьма сходные по морфологии с таковыми у вирулентных микобактерий туберкулеза. 4.5.3. Учет результатов посева диагностического материала При выделении культуры кислотоустойчивых микобактерий, отвечающих вышеперечисленным характеристикам, а именно: — появление роста колоний на плотных питательных средах не — наличие колоний характерной морфологии и окраски; — микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости следует произвести количественную оценку интенсивности роста. Интенсивность роста обозначают по 3-х балльной системе: (1+) — 1 — 20 КОЕ — "скудное" бактериовыделение; (2+) — 21—100 КОЕ —"умеренное" бактериовыделение; (3+) — > 100 КОЕ — "обильное" бактериовыделение. Регистрируют число КОЕ, выросших на каждой из пробирок с разными питательными средами. Величина КОЕ (число колониеобразующих единиц) высчитывается как среднее по результатам подсчета числа колоний, выросших на всех пробирках. Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в компьютерную базу данных полицевого учета.
V. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ МИКОБАКТЕРИИ КОМПЛЕКСА MYCOBATERIUM TUBERCULOSIS
|
