Предварительная идентификация комплекса mycobaterium tuberculosisПервичная идентификация микобактерий комплекса М. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам: скорость роста на плотных питательных средах; пигментообразование; морфология колоний; наличие кислотоустойчивости; температура роста. Таблица 5 Культуральные признаки комплекса М. tube rculosis
Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении микобактерий туберкулеза может быть сделано опытным бактериологом на основании вышеперечисленных характерных признаков, подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерий к комплексу М. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов является обязательным. 5.2. Основные биохимические тесты идентификации М. tuberculosis К сожалению, не существует какого-либо одного лабораторного метода, позволяющего с достоверностью отличить микобактерий комплекса М. tuberculosis от других кислотоустойчивых микобактерий. Тем не менее, сочетание вышеописанных признаков с результатами ряда приводимых ниже биохимических тестов позволяет провести идентификацию микобактерий комплекса М. tuberculosis с точностью до 95% (см. Таблицу 6). Для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий: М. tuberculosis, М. bovis., M. africanum, M. microti — от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий необходимо применять следующие основные биохимические тесты: тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест); тест на наличие нитратредуктазной активности; тест на наличие термостабильной каталазы; тест на наличие роста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл). В качестве дополнительных можно использовать также следующие тесты: рост на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Для дифференциации М. tuberculosis и М. bovis следует учитывать результаты следующих проб: ниациновый тест; тест на наличие нитратредуктазы тест на наличие пиразинамидазы; рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (ТСН). Таблица 6 Тесты для дифференциации микобактерий комплекса М. tuberculosis
*3а исключением М. simae **3а исключением М. gastri **3а исключением М. marinum, M. terrae
Таблица 7 Тесты для дифференциации отдельных видов микобактерий комплекса М. tuberculosis
5.2.1. Ниациновый тест Ниацин (производное никотиновой кислоты) играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерий, однако исследования показали, что у М. tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Ниацинотрицательные штаммы М. tuberculosis встречаются чрезвычайно редко. В то же время ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации М. tuberculosis, так как отдельные штаммы М. bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (М. simiae, M. chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию. Это указывает на необходимость при дифференциации выделенных микобактерий не ограничиваться только ниациновой пробой, а использовать весь рекомендованный выше комплекс реакций. Принцип метода. Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, поэтому именно эта среда используется для проведения ниациновой пробы. Подлежащая дифференциации культура микобактерий должна быть выращена на среде Левенштейна-Йенсена в течение не менее 3-4 недель и должна иметь достаточно массивный (не менее 50 колоний) рост. При отрицательном результате реакции следует повторить ее после 6 или более недель инкубации посева, так как возможно, что молодая культура микобактерий не выделила достаточное для реакции количество никотиновой кислоты. При постановке ниациновой пробы необходимо иметь в виду, что М. tuberculosis выделяют продуцируемую ими никотиновую кислоту в питательную среду, на которой они выращиваются. В связи с этим при наличии на поверхности косяка с питательной средой сливного роста микобактерий возможен ложноотрицательный результат реакции, так как экстрагирующий ниацин реактив не всегда может проникнуть в глубь питательной среды. Для облегчения проникновения экстрагирующего реактива в питательную среду необходимо при наличии на ее поверхности сливного роста микобактерий либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность культуры. Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку. Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками. Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичны при ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Пробу следует проводить только в вытяжном шкафу! Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов. В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия — вещества более безопасного и доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3-4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям. Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В
сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными. Реактивы для пропитывания бумажных полосок: Раствор 1. 20%раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты) В пробирку с 1,75 мл 96° этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК. Смесь подогревают на водяной бане при 56°С в течение 5-10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК. Раствор 2. 60% раствор роданистого калия Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты
(200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды). хлорамина 3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56 - 60°С при периодическом встряхивании. Индикаторные бумажные полоски размером 60x80 мм готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке: - 20% раствор ПАСК — на отмеченный карандашом конец - 60% раствор роданистого калия — на середину полоски; - 50% горячий раствор хлорамина "Б" — на свободный конец - Между каплями должны оставаться сухие промежутки. температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, затем помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.
|
