Процедура исследования. - Добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий 1 — 1,5 мл стерильной дистиллированной воды

- Добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий
1 — 1,5 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии
сливного роста проткнуть поверхность среды в нескольких местах
пипеткой для облегчения доступа раствора к питательной среде;

- поместить пробирку в термостат на 2 — 3 часа в
полугоризонтальном положении с тем, чтобы жидкость покрывала всю
поверхность среды;

- вынуть пробирку из термостата и перевести ее в вертикальное
положение, позволив жидкости стечь на дно в течение 5 — 6 минут;

 

— в чистую стерильную пробирку перенести пипеткой 0,5 — 0,6
мл экстракта;

— индикаторную полоску помеченным карандашом концом, на
который нанесена ПАСК, опустить с помощью пинцета в пробирку с
экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью
средней части полоски, на которую был нанесен роданистый калий;

— немедленно закрыть пробирку резиновой пробкой;

— оставить при комнатной температуре на 15 — 30 минут;
допустимо осторожно покачивать пробирку, пока вся полоска не
пропитается экстрактом;

— наблюдать за окрашиванием жидкости на дне пробирки на
белом фоне.

При положительном ниациновом тесте экстракт окрашивается в желтый цвет разной интенсивности. Любая окраска индикаторной полоски не принимается во внимание, так как это может происходить вследствие окисления реактивов в верхней части полоски. Для дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10% раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым щелочным дезинфицирующим средством.

5.2.2. Тест на наличие нитратредуктазы

При дифференциации микобактерий туберкулеза применяется также реакция восстановления нитратов в нитриты. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерий человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых нетуберкулезных микобактерий, у которых этот фермент отсутствует. Из всех микобактерий нитратредуктазная активность наиболее выражена у М. tuberculosis. Это позволяет использовать данный тест в сочетании с ниациновым тестом для дифференциальной диагностики М. tuberculosis и микобактерий других видов.

Для определения способности микобактерий редуцировать нитраты используют 4-х недельные культуры с обильным ростом, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена.

Принцип метода заключается в определении активности
нитратредуктазы по количеству восстановленного нитрита из нитрата,
что сопровождается цветной реакцией с

парадиметиламинобензальдегидом.

5.2.2.1. Классический метод

Приготовление реактивов: Раствор 1. Нитрат натрия в фосфатном буфере. 0,01 М раствор нитрата натрия в 0,022 М фосфатном буферном растворе (рН = 7,0) готовится следующим образом:

А. 3,02 г КН2РО4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды; Б. 3,16 г Na2HPO4 растворить в 1000 мл дистиллированной воды;

В. 611 мл раствора Б добавить к 389 мл раствора А, хорошо смешать (величина рН раствора должна составлять 7,0).

В 1000 мл полученного буферного раствора (В) растворить 0,85 г NaNO₃.

Разлить полученный раствор 1 в емкости по 100 мл. Стерилизовать в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. При необходимости этот раствор можно переносить по 2 мл в пробирки с завинчивающимися крышками.

Раствор 2. Раствор соляной кислоты

Концентрированная соляная кислота 10 мл

Дистиллированная вода 10 мл

Медленно влить концентрированную соляную кислоту в дистиллированную воду, чтобы получить разведение 1:1. Никогда не вливайте воду в кислоту!

Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Раствор 3. Раствор сульфаниламида (0,2%).
Сульфаниламид 0,2 г

Дистиллированная вода 100 мл

Растворить сульфаниламид в дистиллированной воде. Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.

Раствор 4. Раствор N-нафтилэтилендиамина (0,1%).
Л/-нафтилэтилендиамин 0,1 г

Дистиллированная вода 100 мл

Растворить нафтилэтилендиамин в дистиллированной воде. Хранить полученную смесь в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.