ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ 7 страница

РПГА с цистеином может быть применена с целью контроля прекращения бактерионосительства. Если на фоне прекратившегося бактериовыделения значительно снизится титр антител и особенно цистеинустойчивых IgG, то можно предположить, что произошло освобождение организма от возбудятеля. Прекращение бактерионосительства чаще наблюдается при дизентерии, сальмонеллезах, значительно реже - при брюшном тифе.

Для транзиторных бактерионосителей характерен невысокий титр антител, обусловленный IgM. Если после обработки цистеином в сыворотке остаются IgG - антитела в титре 1:40 и выше, то у такого лица можно предполагать наличие либо субклинической формы инфекции, либо продолжающееся бактерионосительство.

Некоторое повышение титра IgG - антител может происходить в результате многократной специфической вакцинации, поэтому при анализе результатов реакции следует учитывать прививочный анамнез.

Реакция агглютинации с бактериальными диагностикумами при диагностике брюшного тифа, паратифов, других сальмонеллезов и дизентерии.

Исследуемые сыворотки разводят тем же способом, что и для РПГА только в пробирках. В каждый ряд агглютинационных пробирок с разведениями сыворотки и в контрольную (с 0,5 мл ИХН) добавляют по 2 капле соответствующего диагностикума, штатив с пробирками несколько раз встряхивают и помещают в термостат при 37⁰С на ночь. Учет результатов реакции рекомендуется проводить с помощью агглютиноскопа, осторожно встряхивая осадок или медленно наклоняя пробирку. При положительной реакции осадок равномерным слоем покрывает дно пробирки. Края его часто бывают неровные (форма «зонтика»). Надосадочная жидкость прозрачна. После легкого встряхивания пробирки в прозрачной надосадошюй жидкости всплывают хлопья или зерна агглютината. Последнее разведение сыворотки, в котором наблюдают хорошо выраженную агглютинацию, считают ее титром. При отрицательной реакции взвесь сохраняет исходную мутность так же, как в контроле диагностикума.

Условно диагностическим титром считают положительный результат реакции агглютинации с брюшнотифозными и другими сальмонеллезными диагностикумами в разведении 1:200, с диагностакумами Флекснара - 1:400, Зонне, Ньюкастл, Григорьева-Шига, Штуцера-Шмитц - 1:100.

Необходимо помнить, что эти титры не могут служить достоверным доказательством заболевания. Значительно более надежными следует считать увеличение титров в динамике болезни.

Реакция агглютинации с аутоштамами в диагностике заболеваний, вызываемых условно патогенными энтеробактериями.

Диагностическая ценность этой реакции в значительной мере связана с выявлением характера антителообразованяя в динамике заболевания. Оптимальные сроки взятия сыворотки 1-2, 7-10, 14-15-й дни заболевания. Полученные от больного сыворотки следует сохранять в холодильнике и исследовать одномоментно («парные сыворотки»). При специфическом иммунном ответе в конце первой - начале второй недели болезни титр антител нарастает не менее чем в 4 раза, а затем постепенно снижается.

При выделении подвижных культур, представители родов Escherichia, Edwardsiella, Citrobater, Enterobacter, Proteus и др., сыворотку больных исследуют на Н- и О-антитела.

Для Н-агглютинации культуры выращивают на свежескошенном слабо-щелочном питательном агаре в течение 18 часов, затем смывают ИХН и доводят взвесь бактерии до густоты 1 млрд/мл. В ряду из 5 обычных агглютинационных пробирок с 0,25 мл ИХН титруют исследуемую сыворотку, начиная с разведения 1:50, после чего вносят в каждую пробирку, включая одну контрольную с 0,25 мл ИХН по 0,25 мл приготовленной бактериальной взвеси. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в термостат пря 37⁰С на 12 ч. Учитывают реакцию, осторожно покачивая пробирку. Агглютинат имеет вид хлопьев. При невозможности взятия сывороток в динамике болезни ориентировочным титром считают положительный результат реакции Н-агглютинации в разведении 1:100-1:200.

Для 0-агглютинации используют взвесь убитой кипячением суточной агаровой культуры бактерий густотой в 3 млрд/мл ИХН.

Перед постановкой реакции бактериальную взвесь необходимо 2-3 раза отмыть путем центрифугирования. Исследуемую сыворотку титруют в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10 на ИХН в серологических пробирках. В каждую пробирку, включая контрольную, вносят по 1 капле приготовленной бактериальной взвеси, штатив встряхивают и помещают в термостат при 37⁰С на 12 ч. В случае положительной реакции О -агглютинат при осторожном встряхиваний имеет мелкозернистый характер. При невозможности обследования больного в динамике и получении лишь одной сыворотки позже 5 дня болезни условно-диагностическим титром считают положительную реакцию в разведения 1:20 и выше.

 

ГЛАВА 15

ИССЛЕДОВАНИЕ ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

(ВОДА, СМЫВЫ)

Бактериологическое исследование микробной обсемененности объектов внешней среды при пищевых отравлениях предусматривает: выявление бактерий группы кишечной палочки (далее – БГКП) и при необходимости дальнейшее исследование с идентификацией до E.coli, выявление бактерий рода Salmonella, Shigella, Proteus, стафилококка и других микроорганизмов. Забор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов или бакпечатков.

При исследовании следует обращать внимание на разделочные доски, мясорубки, производственные столы для готовой пищи, особенно в цехе приготовления холодных закусок. Смывы с крупного оборудования берут с поверхности 100см², с использованием трафарета, площадью 25см³. При взятии смывов с мелких инструментов обтирается вся поверхность предмета, при заборе смывов с тарелок протирают всю внутреннюю поверхность. При взятии смывов с мелких предметов одним тампоном протирают три одноименных предмета. У столовых предметов протирают их рабочую часть, при исследовании стаканов протирают внутреннюю поверхность и верхний наружный край стакана на 2 см вниз. При взятии смывов с рук протирают тампоном ладонные поверхности обеих рук, проводя не менее пяти раз по каждой ладони и пальцам, затем протирают межпальцевое пространство, ногти и подногтевые пространства. При взятии смывов с санитарной одежды протирают четыре площадки по 25 см², с различных мест полотенца берут четыре площадки по 25 см². При взятии смывов с яичной скорлупы один тампон используют для исследования 10 яиц.

Взятие смывов проводят с помощью стерильных увлажненных ватных тампонов на стеклянной или деревянной палочке, или небольшими марлевыми салфетками (5х5 см), простерилизованными в бумажных пакетах или в чашках Петри. Для увлажнения тампонов в пробирки с тампонами наливают по 5,0 мл стерильного раствора нейтрализатора. При применении дезинфектантов, содержащих хлор или перекись водорода, в качестве увлажняющей жидкости следует использовать раствор нейтрализатора (1% пептонная вода + 3% ТВИН-80 + 0,5% тиосульфата натрия), при применении других - 1% пептонная вода + 3% ТВИН-80 + 0,3% лецитина. При использовании салфеток стерильный раствор нейтрализатора разливают в стерильные флаконы по 5,0 мл. Салфетку захватывают стерильным пинцетом, увлажняют нейтрализатором и, после протирания исследуемого объекта, помещают во флакон. В исключительных случаях для увлажнения тампонов используют стерильный ИХН, или 0,1% пептонную воду, разлитые во флаконы по 5 мл, тампоны увлажняют непосредственно перед взятием смывов. При обработке жирной поверхности следует пользоваться сухими тампонами.

Для выделения стафилококков производят посев смывной жидкости непосредственно на чашку Петри с желточно-солевым агаром, тампон помещают в среду накопления (бульон с 6,5% хлористого натрия, бульон с 1% глюкозы), разлитые в пробирки по 5 мл. Засеянные пробирки инкубируют при 37⁰С в течение 20-24 часов, после чего делают высев на ЖСА. Идентификацию выделенной культуры проводят как описано в главе настоящей Инструкции.

Определение БГКП с идентификацией до E.coli. К БГКП относятся факультативно-анаэробные, грамотрицательные, оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу (глюкозу) с образованием кислоты и газа при (37 + 1)⁰С в течение 24-48 часов, в основном, являющиеся представителями родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Serratia (т.е. учитываются цитратположительные и цитратотрицательные варианты БГКП).

Для выявления БГКП производят посев на среду обогащения, для чего тампон (марлевую салфетку) погружают в 10-20% желчный бульон или среду Кесслера. Через сутки инкубирования при 37⁰С делают пересев на среду Эндо.

При отсутствии на среде Эндо колоний, типичных для БГКП (красных и темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых или бледно-розовых), выдают заключение об отсутствии БГКП. При наличии на среде Эндо характерных колоний из них готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют; выполняют пробу на оксидазу. Наличие в мазках грамотрицательных, оксидазоотрицательных палочек предполагает присутствие БГКП. Исследуемые колонии засевают на среду Гисса с лактозой или глюкозой. Инкубируют 37⁰С 24 часа. Первичный учет проводят через 4-6 ч. Производят пересев на среду Эндо. Все типичные колонии подвергают идентификации по ИМАЦ-тестам (реакция на индол, реакция с метиловым красным, реакция Фогес-Проскауэра, утилизация цитрата). Дальнейшее исследование с идентификацией до E.coli проводят как описано в главе 5 настоящей Инструкции.

При выявлении на среде Эндо мелких бесцветных колоний, подозрительных на наличие возбудителей кишечных инфекций, колонии снимают и изучают на принадлежность к патогенным микроорганизмам семейства Enterobacteriaceae.

При целенаправленном исследовании на выявление бактерий рода Salmonella в пробирку наливают 2 мл предварительной среды обогащения - забуференной пептонной воды рН7,0 (готовят как фосфатно-буферную смесь, но вместо дистиллированной воды используют пептонную воду). Непосредственно перед взятием смыва тампон увлажняют, забирают смыв, тампон погружают в предварительную среду обогащения, инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч. После инкубирования пересевают в среду обогащения (селенитовую, магниевую), в пробирку с посевом смыва добавляют 10 мл среды. Инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч, производят пересев на чашки Петри с плотными питательными средами (висмут-сульфит агар, среда Плоскирева, Эндо, ЭМС и др.), посевы инкубируют при 37⁰С в течение 24 ч. Идентификацию выделенных культур проводят как описано в главе 3 настоящей Инструкции.

При санитарно-бактериологическом контроле на предприятиях пищевой промышленности, общественного питания, торговли пищевыми продуктами, в учреждениях для детей, в организациях здравоохранения возможно применение метода отпечатков на «Бактотесты» (метод обнаружения БГКП), исследования проводятся по МУК РБ 11-15-3-2002.

Исследование проб воды для определения патогенных бактерий кишечной группы проводят по МУК РБ № 11-10-1-2002 «Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды».

 

ГЛАВА 16

УСКОРЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Для ускоренной диагностики и обнаружения патогенных микроорганизмов в первые сутки исследования из объектов внешней среды (вода, смывы, пищевые продукты и т. д.), применяют метод флюоресцирующих антител, или люминесцентносерологический метод, относящийся к однофазовым серологическим реакциям антиген-антитело. Сущность метода заключается в том, что по известному антителу, меченному флуорохромом (изоцианат флуоресцеина, радомин и др.) определяют неизвестный антиген. Происходит соединение антигенов бактерий с соответствующими специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями. Для просмотра препаратов используют люминесцентные микроскопы. Цвет свечения зависит от цвета люминесцентного красителя, применяемого для метки сыворотки. В случае положительной реакции на темном фоне препарата видны клетки характерной морфологии светящиеся по периферии. Оценка результатов проб непосредственно из объектов внешней среды с целью обнаружения возбудителей должна быть очень осторожной. Использование люминисцирующих сывороток позволяют получить ответ, имеющий лишь сигнальное, ориентировочное значение. Основная причина этого - существование общности антигенной структуры среди различных видов бактерий, что приводит к ложноположительному окрашиванию сопутствующей микрофлоры.

Препараты для исследования готовят путем непосредственного нанесения материала на предметное стекло, или с предварительным подращиванием на питательных средах. В первом случае при исследовании жидкого материала делают тонкий мазок, при оформленном стуле, или исследовании пищевых продуктов, готовят 20 % суспензию в ИХН. Для мазка используют верхнюю часть суспензии после ее отстаивания в течение 20 мин. или центрифугировании при 1000 оборотов в мин. в течение 5-10 мин. При подращивании в средах обогащения их выдерживают при 37⁰С в течение 18-24 ч, на плотных средах 24 ч – после чего готовят мазки. Для выявления энтеробактерий используют прямой и непрямой метод.

Прямой метод – мазки исследуемого материала подсушивают на воздухе и фиксируют 96⁰С этиловым спиртом в течение 15 мин или путем трехкратного проведения через пламя горелки. Препараты помещают во влажную камеру, наносят на них каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении на срок, указанный в наставлении по применению люминесцирующей сыворотки. После экспозиции мазки промывают ИХН в течение 10 мин, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. Фиксированные мазки можно хранить несколько дней в холодильнике. Микроскопируют в люминесцентном микроскопе, необходимо просматривать не менее 20-25 полей зрения. Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, имеют яркое зеленоватое свечение периферии клетки, по морфологии соответствующей энтеробактериям. Такое свечение называют специфическим, в отличии от неспецифического, характеризующегося равномерным свечением всего тела клетки. Для оценки интенсивности свечения используют систему четырех плюсов: + + + + очень яркая флюоресценция на перифирии клеток, четко контрастирующая с темным телом бактерий; + + + яркая флюоресценция перифирии клетки; + + или + слабое свечение перифирии клетки не контрастирующая с телом клетки. Положительным результатом считают реакции на + + + + или + + + при наличии 2-5 и более специфически светящихся клеток в каждом поле зрения. В отношении антигенно обособленных энтеробактерий например S.sonnei, для положительного ответа достаточно обнаружить в препарате единичные ярко светящиеся палочковидные микробы. Прямая микроскопия мазка из нативного материала от больных при высокой концентрации возбудителя (500 тысяч -1млн клеток в 1 г, позволяет дать положительный ответ через 45-60 мин.

Непрямой метод на препарат, содержащий антиген, наносят капли диагностической немеченой сыворотки и оставляют при комнатной температуре на 10-20 мин (во влажной камере), промывают ИХН дважды по 10 мин. Мазки подсушивают на воздухеи на 10-20 мин наносят капли люминесцирующей антивидовой сыворотки против глобулинов того вида животного, от которого получена примененная иммунная сыворотка. Мазки промывают и просматривают как при прямом методе. Для непрямого метода обязателен контроль: изучаемый антиген обработанный люминесцирующей сывороткой.

Метод применяют в качестве экспресс-метода индикации. Окончательное заключение может быть выдано только на основании выделения из исследуемого материала возбудителя и полной его дальнейшей идентификации.

Для ускоренного микробиологического исследования пищевых продуктов возможно использование автоматизированных экспресс-методов с использованием микробиологических экспресс-анализаторов,представляющих собой измерительные системы для определения микробной обсемененности и выявления различных микробов, принцип действия которых основан на регистрации изменения электрического сопротивления (импеданса) питательной среды, оптической плотности, турбидиметрического или колоримитрическогоэффекта питательных сред, происходящего под влиянием процессов роста и жизнедеятельности микроорганизмом в исследуемой пробе. Среди разработанных и применяющихся в настоящее время микробиологических экспресс-анализаторов, предназначенных для обнаружения микроорганизмив на основе импедансных технологий наибольшее распространение получили приборы серии «Вак Трак 4000». Прибор автоматически определяет сальмонеллы, энтерококки, S.аureus, B.сereus и др. микроорганизмы, через 6-8 ч можно получить сигнал о возможной обсемененности продукта этими микроорганизмами.

 

ГЛАВА 17

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РЕАКТИВЫ

Глицериновая смесь.

Состав:

Натрий хлорид (Na Cl) (0,85% раствор) 1000 мл

Глицерин нейтральный 500 мл

Натрий гидрофосфат безводный

(Na₂HPO₄) 20 % раствор 150 мл

Приготовление: смешивают первые два ингредиента и добавляют раствор натрия гидрофосата в таком количестве, чтобы довести рН до 7,8-8,0, а затем разливают в пробирки или флаконы по 10 мл, стерилизуют в автоклаве при 112⁰ С в течение 15 мин или текучим паром 3 дня подряд. После стерилизации рН 7,6-7,8.

Фосфатно-буферная смесь.

Состав:

Калий дигидрофосфат (КН₂РО₄) 0,45 г

Натрий гидрофосфат безводный

(Na₂HPO₄) 5,34 г

Вода дистиллированная 1000 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают по 10 мл в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при 120⁰С 30 мин.

Изотонический раствор натрия хлорида.

Состав:

Натрий хлорид (Na Cl) 8,5 г

Вода дистиллированная 1000 мл

Приготовление: соль растворяют при подогревании, фильтруют, устанавливают рН 7,0-7,2, разливают в пробирки по 5-7 мл, стерилизуюь при 121⁰С 30 мин.

Селенитовая среда.

Состав:

Дистиллированная вода 1000 мл

Натрий кислый селенисто-кислый (NaHSeCb) 4 г

Пептон 5 г

Натрий фосфорнокислый

двузамещенный, безводный (Na₂HPO₄) 7г

Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NaH₂PO₄) 3 г

Лактоза (химически чистая) 4 г

Приготовление:

Раствор № 1. Для приготовления селенитовой среды необходима предварительная подтитровка ее составных частей так, чтобы рН >не был выше 7,0(6,9-7,1), что достигается путем изменения соотношения фосфатных солей. Причем подтитровка проводится всякий раз, когда меняется серия любого из вхо­дящих в среду основных ингредиентов (пептон, кислый селенистокислый натрий, фосфаты).

К приготовленному раствору фосфатных солей в воде (1000 мл) до­бавляют пептон и лактозу.

Разливают во флаконы по 50 мл и стерилизуют текучим паром в те­чение 2-х дней по 30 минут или при температуре 112⁰С в течение 30 минут.

Раствор № 2. Отдельно на стерильной дистиллированной воде готовят 10% раствор кислого селенистокислого натрия. Перед началом работы в каждый фла­кон с 50 мл раствора № 1 добавляют 2 мл 10% раствора кислого селени­стокислого натрия.

Приготовленную среду разливают в стерильные пробирки по 5-7 мл и закрывают плотно пробками. Стерилизация готовой среды не допускается, так как при этом проис-дит редукция селенита натрия, выпадает красный осадок и среда становится непригодной. Раствор № 1 может храниться, в холодильнике в течение 1-2 месяцев.

Среда магниевая.

Раствор № 1:

Пептон 8,4 г

Хлористый натрий (NaCl) 14,3 г

Дрожжевой диализат 40,0 мл

Калий фосфорнокиелый (КН₂РО₄). 2,85 г

Вода дистиллированная 890,0 мл

Раствор № 2:

Хлористый магний кристаллический (MgCl₂ .6H₂O) 71,4 г

Вода дистиллированная 90,0 мл

Раствор № 3:

0,5% водный раствор бриллиантового зеленого 1,8 мл

После растворения всех ингредиентов растворы соединяют, разливают определенные объемы в колбы, флаконы или пробирки и стерилизуют при 112⁰С 30 минут.

Пропись предусматривает посевы равных объемов исследуемой жидкости и среды обогащения. При исследовании плотного материала в состав среды вводится двойное количество дистиллированной воды.

Среда Мюллера

К 90 мл стерильного бульона Хоттингера добавляют: 4,5г мела, предварительно простерилизованного сухим жаром; 10 мл раствора натрия тиосульфата (50 г чистого кристаллического натрия тиосульфата в 100 мл дистиллированной воды стерилизуют текучим паром); 2 мл раствора Люголя (металлического йода 25 г, йодистого калия 20 г, дистиллированной воды 100 мл). Указанные ингредиенты смешивают, взбалтывают, разливают по пробиркам. Готовая среда стерилизации не подлежит.

Среда Кауфмана

Состав:

Среда Мюллера (стерильная) Стерильная бычья желчь 0,1% водный раствор бриллиантового зеленого

1000 мл 50 мл 10 мл

Перемешать, разлить в стерильные пробирки, не стерилизовать.

Тетратионатная среда (Мюллер-Кауфман)

Основа среды: в 100см³ мясо-пептонного бульона добавляют 4,5 г стерильного углекислого кальция. Стерилизуют при 121⁰С 20 минут. К 100см³ основы среды асептически прибавляют: 10см³ раствора гипосульфита натрия Na₂ S ₂O₃. 5Н₂О, 2см³ йодного раствора, 0,2 см³ раствора бриллиантового зеленого, 5см³ раствора желчи. Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления. Среду допускается использовать в течение одной недели после приготовления.

Раствор гипосульфита натрия: 50,0г гипосульфита натрия помещают в колбу вместимостью 100см³, растворяют в дистиллированной воде и доводят до метки. Раствор переливают в колобу или флакон и стерилизуют текучим паром 30мин или при 121⁰С 20 минут.

Йодный раствор: 25,0г йодистого калия помещают в колбу вместимостью 100см³ растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют 20г кристаллического йода, растворяют, объем растворв доводят дистиллированной водой до метки, хранят в плотно закрытом темном сосуде.

Раствор бриллиантового зеленого: 0,5г бриллиантового зеленого переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде, раствор переливают в колбу вместимостью 100см³ и доводят дистиллированной водой до метки, хранят в плотно закрытом темном сосуде при комнатной температуре не более 3 месяцев.

Раствор желчи: 10,0г сухой желчи растворяют в 100см³ количестве дистиллированной воды, или используют натуральную желчь, стерилизуют при 121⁰С 20 минут.

Забуференная пептонная вода

10,0г пептона, 5,0г хлористого натрия, 9,0г двузамещенного фосфарнокислого натрия (Na₂HPO₄. 12 H₂O) 1,5г однозамещенного фосфарнокислого калия растворяют при нагревании в 1000см³ дистиллированной воды, устанавливают рН так, чтобы после стерилизации он составлял при 25⁰С 7,0 + 0,1, стерилизуют при 121⁰С 20 мин.

Среда Рапопорт

Состав:

Мясо-пептонный бульон Стерильная бычья желчь Глюкоза Раствор индикатораАндредэ

1000 мл 100мл 20г 10мл

Разлить во флаконы с поплавками по 50 мл. Стерилизовать текучим паром три дня по 30 минут.

Трехсахарный агар с солями железа (TSI)

Состав:

Мясная вода	1000 мл
Дрожжевой экстракт жидкий	100 мл
или
Дрожжевой экстракт по сухой массе Пептон Натрий хлорид (NaCl) Агар Железо (II) сульфат (FeSO4-7H2O), перекристаллизованное Натрий тиосульфат (Na2S2O3-5H2O) Глюкоза Лактоза Сахароза Феноловый красный (0,2 % водный раствор)	3 г 20 г 3,5 г 15 г   0,2 г 0,3 г 1,0 г 10 г 10 г 12 мл

Приготовление: готовят основу, к мясной воде добавляют дрожжевой экстракт, пептон, натрия хлорит и агар. Смесь подогревают до расплавления агара, устанавливают рН 7,0-7,1. Фильтруют, разливают во флаконы по 0,5 л, стерилизуют при 121⁰С 30 мин. К стерильной основе добавляют остальные ингридиенты, разливают асептично в пробирки по 6-7 мл, стерилизуют при 112⁰С 30 мин. Скашивают в горячем виде, так, чтобы оставить столбик высотой 2,5-3,0 см.

Трехсахарный агар с мочевиной (среда Олькеницкого)

Состав:

Агар питательный сухой Лактоза Сахароза Глюкоза Аммоний-железо (II) сульфат (FeZO4.(NH4)2SO4.6Н2О) Натрий тиосульфат (Na2S2O3.5H2O) Мочевина Феноловый красный (0,4 % водный раствор) Вода дистиллированная

25 г 10 г 10 г 1 г 0,2 г 0,3 г 10 г 4 мл 1000 мл

Соли предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. Углеводы и мочевину растворяют таким же образом, но при подогревании в водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в остальной воде при нагревании на огне и помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4. Добавляют индикатор, хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 6-7 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 мин. Скашивают, оставляя столбик 2-2¹/₂ см.

Готовая среда бледно-розового цвета.

Среда Дорсе.

Готовится из диетических яиц. Скорлупу яиц тщательно обрабатывают спиртом. Содержимое яиц сливают в стерильную колбу с бусами, встряхивают до образования гомогенной массы, добавляют стерильный фи­зиологический раствор из расчета 25 мл на 1 яйцо.

Смесь разливают в стерильные пробирки по 4-5 мл и скашивая продевают в аппарате Коха при 80⁰С в течение 1 часа 2 дня подряд. Среда не подлежит стерилизации.

Раппапорт-Вассилиадис соево-пептонный бульон (RVS).

Основа:

Соевый пептон 5г.

Хлорид натрия 8г.

KH₂PO₄ 1,4г.

K₂HPO₄ 0,2г.

Дистиллированная вода 1000мл.

Нагреть содержимое до 80⁰С, до полного растворения ингридиентов. Раствор хранится один день.

Раствор хлорида магния:

Хлорид магния 400г.

Дистиллированная вода 1000мл.

Растворить хлорид магния в воде. Хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 2 часов.

Раствор малахитового зеленого:

Оксалат малахитового зеленого 0,4г.

Дистиллированная вода 100мл.

Растворить соль в воде. хранить в темной посуде при комнатной температуре в течение 8 месяцев.

Состав среды:

Основа 1000мл.

Раствор хлорида магния 100мл.

Раствор малахитового зеленого 10мл.

Смешать компоненты среды и разлить содержимое по 10мл в пробирки. Автоклавировать при 115⁰С в течение 15мин. Проверить рН, которое после стерилизации должна быть 5,2+0,2 при 25⁰С. Хранить при 4⁰С максимум 4 месяца.

Бриллиантовый-зеленый агар (BGA).

Состав:

Пептон 10г.

Дрожжевой экстракт 3г.

Хлорид натрия 5г.

Лактоза 10г.

Сахароза 10г.

Феноловый красный 0,09г.

Бриллиантовый зеленый 0,0047г.

Агар 12г.

Дистиллированная вода 1000мл.

Все ингридиенты растворить в воде и нагреть содержимое в течение 1мин. Проверить рН среды (6,7-7,1) и разлить в бутылки по 1000мл. Не автоклавировать.

Висмут - сульфитный агар с феноловым красным.

Состав:

Мясопептонный бульон	1000 мл
Натрий хлористый (NaCl)	20 гр
Феноловый красный	0,02 гр
Агар	15 гр

Смешивают все ингредиенты и нагревают до кипения и полного растворения всех ингредиентов. Затем охлаждают до 50⁰С, устанавливают рН 8,6 и стерилизуют при 121⁰С - 15 минут. Охлаждают до 50⁰С и добавляют 100 мл раствора висмут-сульфита и 1 мл 95 % этилового спирта.

Раствор висмут-сульфита.

Растворяют 100 г сернисто-кислого натрия (Na₂SO₃) в 500 мл кипящей воды (1); 30 г аммоний –висмут лимонно-кислого в 250 мл кипящей воды (2); 50 г сахарозы, 5 г маннита, 15 г бикарбоната натрия (NaНСO₃) в 300 мл кипящей воды (3). Растворы 1 и 2 смешивают и кипятят 1 минуту. Прибавляют раствор (3) и смешивают. Раствор хранят в холодильнике в течение 1 месяца.

Висмут-сульфит - солевой бульон

Состав:

Дистиллированная вода Пептон Хлористый натрий (NaCl) Хлористый калий (КС1) Хлористый магний (MgСl2-6H2O)

950 мл 10 г 25 г 0,7 г 5 г

Устанавливают рН 9,1 добавлением 10% водного раствора углекислой соды. Стерилизуют при 121⁰С 15 минут, охлаждают до комнатной температуры и добавляют асептично 100 мл раствора Сернистокислого висмута и 1 мл этилового спирта 96°.