Определение количества лейкоцитов

Количество лейкоцитов подсчитывают при помощи автоматического счетчика или в камере Горяева. Для подсчета лейкоцитов в камере готовят жидкость Тюрка — раствор уксусной кислоты, подкрашенный водным раствором метиленового синего (на 9 мл 10% уксусной кислоты добавляют 0,1 мл 0,1% раствора метиленового синего). В пробирку наливают 0,4 мл жидкости Тюрка. Набирают точно 0,02 мл крови, осторожно добавляют к разводящей жидкости. Разведение крови составляет 1:20. Смесь хорошо перемешивают и оставляют на 4 мин. Заполняют камеру Горяева, предварительно тщательно встряхнув пробирку с разведенной кровью. Камеру оставляют на 1 мин на ровной поверхности для оседания лейкоцитов. Затем подсчитывают лейкоциты при малом увеличении микроскопа (объектив 8, окуляр 10 или 15) при затемненном поле зрения (при опущенном конденсоре или суженной диафрагме). Лейкоциты считают в 100 неразграфленных больших квадратах, что соответствует 1600 малым. Результаты подсчета клеток в больших квадратах суммируют и производят вычисление их количества в 1 мкл крови по формуле:

где X — количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А — количество клеток, сосчитанных в 100 больших квадратах;1600 — количество малых квадратов; 20 — разведение крови; 4000 — множитель,приводящий результат к объему 1 мкл крови, исходя из объема малого квадрата (1/4000 мкл).

Подсчет лейкоцитарной формулы. Исследуют окрашенные мазки периферической крови. Необходимым условием для правильного учета морфологических особенностей кровяных клеток является правильно сделанный и хорошо окрашенный мазок крови. Мазок крови готовят на сухих, чистых, хорошо обезжиренных предметных стеклах, выдержанных в смеси Никифорова (этиловый спирт 96º и диэтиловый эфир 1:1). Взяв предметное стекло за длинные края, прикасаются его поверхностью к капле крови (но не к коже), выпущенной из прокола, либо наносят каплю крови микропипеткой или капилляром. Предметное стекло держат на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставляют шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью слева от капли под углом 45° и продвигают его вправо до соприкосновения с кровью. Выжидают, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем легким быстрым движением ведут его справа налево до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерена так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя 1-1,5 см до его края. Хорошо сделанный мазок тонок, имеет желтоватый цвет и оканчивается «метелочкой». Высохшие на воздухе мазки крови, опускают в специальную посуду для фиксации или в обыкновенные стеклянные стаканы, наполненные фиксирующей жидкостью (метиловый спирт, время фиксации 3-5 мин; этиловый спирт, 30 мин; смесь Никифорова, 20-30 мин). Зафиксированные препараты сушат на воздухе, после чего окрашивают красителем Романовского-Гимзы. Готовый раствор краски Романовского-Гимза (азурэозин) разводят 1:10 в необходимом для окрашивания объеме. Фиксированные мазки заливают разведенной краской, которую наливают на мазок возможно более высоким слоем. Окрашивание длится в зависимости от температуры воздуха в помещении от 25 до 45 мин. После окончания окраски краску смывают дистиллированной водой и ставят мазки вертикально в деревянный штатив для просушивания. Микроскопию мазков крови проводят с иммерсией при увеличении 100×10. Подсчет лейкоцитов ведут по зигзагообразной линии («линии Меандра»), Подсчитывают 100-200 клеток, учитывая количество отдельных форм лейкоцитов: палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, моноциты, лимфоциты. Вычисляют процент каждого типа клеток.

Подсчет абсолютного числа фагоцитов и лимфоцитов. Абсолютное число фагоцитов (нейтрофилов и моноцитов) и лимфоцитов высших позвоночных вычисляют на основании данных о количестве лейкоцитов в периферической крови и лейкоцитарной формулы.

Исследование фагоцитарной функции

Определение фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа

Для оценки поглотительной и переваривающей активности лейкоцитов разработано большое число методик. Все они основаны на способности фагоцитов поглощать чужеродные частицы, входящие в состав тест-системы (конкретный вид микроорганизмов, зимозан, латекс — объект поглощения). Рекацию проводят in vitro или in vivo. Общий ход определения заключается в следующем: смешивают гепаринизированную или цитратную свежевзятую кровь (или суспензию фагоцитов) с равным объемом взвеси отмытой суточной микробной культуры (Saccharomyces cerevisiae, Staphilococcus aureus, S. albus, E.coli, A. нydrophila) или другого объекта поглощения. Смесь осторожно перемешивают и помещают в термостат (37-40ºС — для теплокровных в зависимости от нормальной температуры организма, 26°С — для теплолюбивых рыб и более низкой для холодолюбивых). Через 15, 30, 45, 60 и 90 мин готовят мазки на предметных стеклах, высушивают, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова и окрашивают по Романовскому-Гимза. Просматривают мазки под иммерсией и определяют фагоцитарную активность – процент фагоцитов, участвующих в фагоцитозе, фагоцитарный индекс – количество тест-микробов, захваченных одним фагоцитирующим лейкоцитом, фагоцитарное число – среднее число фагоцитированных объектов, приходящееся на 1 активный нейтрофил. Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 мин фагоцитарный индекс должен быть ниже, чем через 45 мин и 60 мин, в связи с перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не меняется.

Оценка функциональной активности фагоцитов по реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Данный тест является показателем бактерицидной функции фагоцитов и позволяет оценить их способность к кислородзависимому киллингу. При задействовании этого механизма киллинга активируется фермент - НАДФ-оксидаза, который приводит к появлению в фагоците активных форм кислорода. Выброс таких веществ в клетке называется кислородный (респираторный) взрыв, который можно зарегистрировать с помощью НСТ-теста. При постановке этого теста к фагоцитам добавляют вещество нитросиний тетразолий, оно поглащается клеткой и в присутствии активных форм кислорода переходит в темно-синие окрашенное вещество — диформазан. Чем больше темно-синих гранул фиксируется на поверхности или внутри фагоцита, тем больше образовалось активных форм кислорода, тем сильнее кислородзависимый киллинг.

НСТ-тест ставят в двух вариантах: спонтанный и индуцированный. При постановке спонтанного НСТ-теста фагоциты культивируют в присутствии НСТ без предварительной активации клеток, при проведении индуцированного НСТ-теста в среду культивирования добавляют активатор фагоцитарной реакции. Постановка НСТ-теста в двух вариантах позволяет рассчитать функциональный резерв клеток, который представляет собой разницу между числом (интенсивностью) индуцированных диформазанпозитивных клеток и количеством (интенсивностью) спонтанных диформазанпозитивных клеток. Значения индуцированного НСТ-теста характеризуют активность фагоцитирующих клеток в присутствии антигенного раздражителя и рассматриваются как критерий их готовности к завершенному фагоцитозу. Спонтанный НСТ-тест позволяет оценить степень активации кислородзависимых механизмов киллинга неактивированных фагоцитов. Он характеризует степень активации внутриклеточных микробоцидных систем.

Для постановки спонтанного НСТ-теста к 0,1 мл крови добавляют 0,05 мл 0,2% раствора НСТ в калий-фосфатном буфере (0,1, рН 7,3) и 0,05 мл того же буфера. Параллельно ставят пробу для учета индуцированного НСТ-теста, в которую вместо 0,05 мл буфера добавляют такой же объем активатора фагоцитарной реакции (например, пирогенал вконцентрации 50 мкг/мл). Реакционную смесь термостатируют на водяной бане при 37 °С (30–60 мин). Готовят мазки средней плотности, высушивают на воздухе и фиксируют в этиловом спирте или смеси Никифорова (20 мин), после чего окрашивают водным раствором нейтрального красного (0,1%, 1 мин)

Мазки крови после постановки реакции микроскопируют под иммерсией (объектив 100×, окуляр 10×). Среди 100 клеток подсчитывают долю активированных нейтрофилов (ДАН, %), содержащих гранулы диформазана. По количеству отложившегося в клетках диформазана оценивают их активность в условных единицах и рассчитывают индекс активации нейтрофилов (ИАН, усл.ед.):

ИАН = (НСТ_отриц. ×0 + НСТ₁× 1 + НСТ₂×2 + НСТ₃×3) / 100

 

где Н_отриц. - количество клеток, не содержащих гранул диформазана;

Н₁ — количество клеток, в которых площадь отложений диформазана менее 1/3 площади ядра;

Н₂ — количество клеток, в которых отложения диформазана занимают от 1/3 до всей величины ядра;

Н₃ — количество клеток, в которых отложения диформазана занимают больше площади ядра.

Выведение коэффициента мобилизации (КМ) осуществляют по следующей формуле:

 

ДАН (%) в индуцированном тесте

КМ = ---------------------------------------------------

ДАН (%) в спонтанном тесте