РИСУНКИ

 

ПРИЛОЖЕНИЕ О

Заявка на изобретение: 2007134194

Дифференцирующий и специфический олиго-нуклеотид для идентификации последовательностей ДНК трансгенных растений в пищевых продуктах, способ идентификации трансгенных продуктов, биочип, комбинация олигонуклеотидов (варианты) и набор для осуществления этого способа

1. Способ идентификации маркеров генетически модифицированных растений, включающий обеспечение образца исследуемой ДНК, прямых и обратных праймеров, специфичных к ДНК одного или более маркеров ГМИ, и биочипа, проведение ПЦР в присутствии образца ДНК и специфичных праймеров с зондами, специфичными к указанному одному или более маркерам, обработку продуктов ПЦР реакции ферментом, инкубацию ПЦР-продукта с биочипом в условиях гибридизации, определение наличия ГМИ детекцией образованных гибридизационных комплексов на биочипе, отличающийся тем, что биочип содержит дифференцирующие олигонуклеотиды, с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:23-33, в качестве специфичных праймеров используют праймеры, последовательность которых выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-22, в качестве ПЦР используют мультипраймерную симметричную ПЦР, продукты которой обрабатывают экзонуклеазой фага лямбда в концентрации от 5 до 20 единиц активности в течение от 30 до 90 мин, где в паре прямого и обратного праймеров, один праймер содержит метку, которую после гибридизации ДНК детектируют, регистрируют и используют для идентификации маркеров ГМИ, причем в качестве отрицательного контроля используют дифференцирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:36, частично комплементарный олигонуклеотиду SEQ ID NO:8, а в качестве положительного контроля используют дифференцирующий олигонуклеотид SEQ ID NO:34, которому комплементарен специфический олигонуклеотид SEQ ID NO:35.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводят детекцию образцов на наличие в них, по крайней мере, одной ДНК, принадлежащей гену, входящему в перечень маркеров ГМИ, приведенных в таблице 1.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что образец исследуемой ДНК выделяют, по крайней мере, из одного образца, содержащего ГМИ, входящего в группу, состоящую из плодов или сока растений, зерна, муки, или пищевых продуктов, в состав которых входят генетически модифицированные растения.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что определяемую метку выбирают из группы, состоящей из каталитических, лигандных, флуоресцентных или радиоактивных молекул, причем каталитическую молекулу выбирают из группы, включающей гемин, цианкобаламин или флавин, лигандную молекулу выбирают из группы, включающей биотин, диоксигенин или динитробензол, а флуоресцентную молекулу выбирают из группы, включающей FAM, TAMRA, Су3, Су5, Су7, R6G, R110, ROX или JOE.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектирование и/или идентификацию ГМИ осуществляют путем сравнительного анализа уровня сигналов исследуемого образца, положительного и отрицательного контролей.

6. Специфический олигонуклеотид в качестве праймера ПЦР для идентификации маркера ГМИ в способе идентификации ГМИ по пп.1-5 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:22.

7. Дифференцирующий олигонуклеотид в качестве зонда для идентификации маркера ГМИ в способе идентификации ГМИ по пп.1-5 с последовательностями, представленными от SEQ ID NO:23 по SEQ ID NO:33.

8. Биочип для идентификации ГМИ, представляющий собой несущий элемент, характеризующийся тем, что на его поверхности иммобилизированы от 1 до 11 кластеров с дифференцирующими олигонуклеотидами, выбранными из SEQ ID NO:23-33, один или более кластеров, включающих олигонуклеотид положительного контроля, представленный в SEQ ID NO:34, и один или более кластеров, включающих олигонуклеотид отрицательного контроля, представленный в SEQ ID NO:36.

9. Биочип по п.8, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен из материалов, входящих в группу, состоящую из: полимеров, стекла, металлов, керамики или их комбинаций.

10. Биочип по п.9, отличающийся тем, что полимеры выбирают из группы, состоящей из: полиметилметакрилата, полибутилметакрилата, поливинилхлорида, поликарбоната, сополимеров метилметакрилата и/или сополимеров бутилметакрилата с другими мономерами, такими как стирол, акрилонитрил.

11. Биочип по п.8, отличающийся тем, что несущий элемент чипа выполнен в виде плоских платформ, пленок с толщиной от 0,05 до 5,0 мм.

12. Биочип по п.8, отличающийся тем, что дополнительно содержит идентификатор выполненный в виде штрих-кода или элемента с магнитной записью.

13. Биочип по п.12, отличающийся тем, что идентификатор биочипа включает код номера партии и/или даты изготовления и информацию о перечне размещенных дифференцирующих олигонуклеотидов.

14. Набор для идентификации ГМИ, включающий:

а) по меньшей мере, один биочип для проведения разовой диагностики, содержащий один или более дифференцирующих олигонуклеотидов, специфичных к идентифицируемым маркерам трансгенных растений, и представленных в SEQ ID NO:23-33, один или более дифференцирующих олигонуклеотидов в качестве положительного контроля, представленных в SEQ ID NO:34, и один или более дифференцирующих олигонуклеотидов в качестве отрицательного контроля, и представленных в SEQ ID NO:36,

б) реагенты, которые выбирают из реагентов для подготовки образца, реагентов для проведения ПЦР, реагентов для проведения гибридизации и их комбинации и фермента экзонуклеазы.

в) специфические олигонуклеотиды в качестве праймеров ПЦР для выявления маркеров ГМИ с последовательностями, которые выбирают от SEQ ID NO:1 по SEQ ID NO:22.

15. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера 35S преимущественно для идентификации 35S промотора из вируса мозаики цветной капусты, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:23, и SEQ ID NO:1, и SEQ ID NO:2.

16. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера NOS преимущественно для идентификации 3' нетранслируемой области гена нопалинсинтазы, отличающаяся тем, включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:24, и SEQ ID NO:3, и SEQ ID NO:4.

17. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера OCS преимущественно для идентификации 3' нетранслируемой области гена октопинсинтазы, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:25, и SEQ ID NO:5, и SEQ ID NO:6.

18. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера NPTII преимущественно для идентификации гена кодирующего неомицин-фосфотрансферазу II, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:26, и SEQ ID NO:7, и SEQ ID NO:8.

19. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера GUS преимущественно для идентификации гена кодирущего бета-глюкуронидазу, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:27, и SEQ ID NO:9, и SEQ ID NO:10.

20. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера Lectin преимущественно для идентификации гена семейства Lel из Glycine max, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO: 28 в качестве зонда и два специфических SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12.

21. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера Zein преимущественно для идентификации гена семейства Zein из Zea Mays, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:29, и SEQ ID NO:13, и SEQ ID NO:14.

22. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера bar преимущественно для идентификации гена из Streptomyces hygroscopicus, кодирущего фосфотрицин-ацетилтрансферазу, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:30, и SEQ ID NO:15, и SEQ ID NO:16.

23. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера cry1Ab преимущественно для идентификации гена из Bacillus thuringiensis, кодирующего Bt-токсин, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:31, и SEQ ID NO:17, и SEQ ID NO:18.

24. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера EPSPS преимущественно для идентификации гена из Agrobacterium tumefaciens, кодирующего 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:32, и SEQ ID NO:19, и SEQ ID NO:20.

25. Комбинация олигонуклеотидов для выявления маркера Patatin преимущественно для идентификации гена pat1 из Solanum tuberosum, кодирующего предшественник пататина, отличающаяся тем, что включает олигонуклеотиды с последовательностями SEQ ID NO:33, и SEQ ID NO:21, и SEQ ID NO:22.

 

 

ПРИЛОЖЕНИЕ П

Описание изобретения к патенту: 2294633

 

ПРИЛОЖЕНИЕ Р

Описание изобретения к патенту: 2413774

 

ПРИЛОЖЕНИЕ С

Заявка на изобретение: 2008114535